CRISPR/Cas9 adalah teknologi pengeditan gen revolusioner yang memungkinkan para ilmuwan membuat perubahan tepat pada DNA organisme hidup. Awalnya ditemukan sebagai sistem kekebalan bakteri, ia telah diadaptasi menjadi alat serbaguna untuk penelitian genetika, kedokteran, dan bioteknologi.
Cara Kerja CRISPR/Cas9
- Panduan Desain RNA
RNA panduan singkat (gRNA) dirancang untuk melengkapi urutan DNA target. GRNA memiliki panjang sekitar 20 nukleotida dan menentukan di mana enzim Cas9 akan dipotong. Urutan target harus langsung diikuti oleh urutan motif berdekatan protospacer (PAM), biasanya NGG.
- Formasi Kompleks
GRNA digabungkan dengan protein Cas9, membentuk kompleks ribonukleoprotein. GRNA bertindak sebagai GPS, memandu Cas9 ke lokasi tepat dalam genom yang cocok dengan urutan gRNA.
- Pengikatan dan Pembelahan DNA
Kompleks Cas9-gRNA memindai DNA untuk urutan PAM. Setelah ditemukan, Cas9 membuka gulungan DNA dan memeriksa apakah urutan yang berdekatan cocok dengan gRNA. Jika cocok, Cas9 menciptakan pemutusan untai ganda pada DNA.
- Perbaikan DNA
Mekanisme perbaikan alami sel mengambil alih. Ada dua jalur utama:
- Penggabungan ujung non-homolog (NHEJ): Ujung yang patah disatukan kembali secara langsung, sering kali menyebabkan penyisipan atau penghapusan kecil yang mengganggu gen.
- Perbaikan yang diarahkan pada homologi (HDR): Jika templat perbaikan disediakan, sel akan menggunakannya untuk melakukan pengeditan yang tepat atau menyisipkan materi genetik baru.
- Verifikasi
Sel atau organisme yang diedit dianalisis dengan PCR dan diurutkan untuk memastikan modifikasi genetik yang diinginkan berhasil.
Desain Eksperimen CRISPR Praktis
Rancang panduan RNA menggunakan alat online seperti CRISPick (Broad Institute) atau CHOPCHOP. Masukkan urutan gen target dan pilih gRNA dengan peringkat tertinggi dengan prediksi situs di luar target yang minimal (skor MIT rendah). Pesan gRNA sebagai dua oligonukleotida komplementer dengan overhang untuk kloning menjadi vektor ekspresi (misalnya, pX459 untuk seleksi SpCas9 dan puromisin), atau beli gRNA yang ditranskripsi in vitro dan protein Cas9 rekombinan untuk pengiriman RNP. Untuk pembentukan RNP, campurkan 100 pmol protein Cas9 dengan 120 pmol gRNA dalam 10 µL PBS, inkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Kirimkan RNP ke dalam sel berukuran 2×10^5 dengan cara elektroporasi menggunakan sistem Neon atau Lonza dengan program yang direkomendasikan untuk jenis sel tersebut. Setelah 48 jam, ekstrak DNA genom dan amplifikasi PCR pada wilayah target (300–600 bp berpusat pada lokasi pemotongan). Sanger mengurutkan produk PCR dan menganalisis kromatogram menggunakan ICE (Inference of CRISPR Edits) atau perangkat lunak TIDE — alat ini menguraikan jejak campuran untuk mengukur efisiensi pengeditan (persentase indel) dan mengidentifikasi pengeditan yang paling umum. Eksperimen yang berhasil menghasilkan efisiensi pengeditan 30–80% dalam sel HEK293T. Untuk pengeditan presisi yang dimediasi HDR, kirimkan bersama templat perbaikan oligodeoksinukleotida (ssODN) untai tunggal (100–200 nt, dengan lengan homologi 50 nt di setiap sisinya) pada 10 pmol per reaksi.
Aplikasi Dunia Nyata
Dalam studi KO gen TP53 dalam sel HCT116, gRNA yang menargetkan ekson 4 dirancang melalui CRISPick. Elektroporasi RNP mencapai efisiensi pengeditan 65% dengan analisis ICE. Kloning sel tunggal mengisolasi klon knockout homozigot yang dikonfirmasi oleh sekuensing Sanger yang menunjukkan penghapusan 2 bp yang menyebabkan pergeseran bingkai dan kodon stop prematur. Western blot menegaskan tidak adanya protein p53.
