Sementara CRISPR/Cas9 digunakan untuk mengedit gen individu, skrining CRISPR meningkatkan skala rekayasa genom ke seluruh genom dalam satu eksperimen, mengidentifikasi gen yang memberikan resistensi, sensitivitas, atau fenotipe spesifik.
Prinsip
Skrining CRISPR terkumpul menggunakan pustaka sekuens single-guide RNA (sgRNA) yang menargetkan setiap gen dalam genom (atau subset terfokus). Setiap sgRNA mengarahkan Cas9 untuk membuat pemutusan untai ganda di lokus genomik spesifik, menghasilkan knockout. Dengan melacak sgRNA mana yang diperkaya atau dimiskinkan dalam populasi di bawah seleksi, skrining mengidentifikasi gen yang relevan secara fungsional.
Desain Pustaka
Pustaka CRISPR genomik (Brunello, TKOv3, GeCKO) mengandung 4–6 sgRNA per gen, plus 100–1000 kontrol non-target. Setiap sgRNA adalah sekuens 20 nt yang menargetkan situs yang berdekatan dengan PAM dalam genom. Pustaka disintesis sebagai pool oligonukleotida, dikloning ke dalam vektor lentiviral, dan dikemas ke dalam lentivirus.
Alur Kerja Skrining
- Transduksi: Menginfeksi sel yang mengekspresikan Cas9 dengan pustaka sgRNA lentiviral pada multiplicitas infeksi rendah (MOI ~0,3) sehingga sebagian besar sel menerima satu sgRNA. Gunakan sel yang cukup untuk mempertahankan representasi ~500× setiap sgRNA.
- Seleksi: 48 jam setelah transduksi, tambahkan puromisin (atau antibiotik seleksi lain) untuk menyeleksi sel yang telah mengintegrasikan pustaka.
- Seleksi fenotipik: Setelah 7–14 hari propagasi, terapkan kondisi eksperimental: perlakuan obat, paparan toksin, starvation, atau sortir sel berdasarkan reporter. Populasi kontrol paralel dikultur tanpa seleksi.
- Sekuensing: Ekstrak DNA genomik dari kedua populasi, PCR-amplifikasi wilayah pengkode sgRNA, dan sekuensing pada platform Illumina.
- Analisis: Sejajarkan bacaan ke referensi pustaka, hitung sgRNA per gen, dan hitung perubahan lipat antara populasi terseleksi dan kontrol. Gen dengan sgRNA yang dimiskinkan secara signifikan esensial untuk kelangsungan hidup; sgRNA yang diperkaya menunjukkan gen resistensi.
Pertimbangan Kunci
- Representasi: Pertahankan setidaknya 500 sel per sgRNA selama skrining untuk menghindari artefak dropout.
- Ekspresi Cas9: Sel harus mengekspresikan Cas9 pada tingkat tinggi. Garis sel yang mengekspresikan Cas9 secara stabil atau garis knock-in Cas9 lebih disukai.
- Kontrol: Sertakan kontrol toksisitas (misalnya, dosis obat tinggi) untuk mengonfirmasi bahwa pemiskinan bersifat spesifik, dan kontrol tanpa seleksi untuk memperhitungkan efek pertumbuhan dari sgRNA itu sendiri.
Aplikasi
Skrining CRISPR telah digunakan untuk mengidentifikasi mekanisme resistensi terhadap kemoterapi, terapi target, dan imunoterapi; menemukan faktor inang yang diperlukan untuk infeksi virus; memetakan interaksi letal sintetik dalam kanker; dan mengidentifikasi gen yang mengatur diferensiasi, migrasi, dan metabolisme sel.
Perbandingan dengan Skrining shRNA
Skrining CRISPR menghasilkan knockout lengkap (mutasi pergeseran kerangka) daripada knockdown (degradasi mRNA), memberikan kehilangan fungsi yang lebih konsisten dan lengkap. Mereka memiliki efek off-target lebih sedikit daripada shRNA karena sekuens target yang lebih panjang (20 nt vs. 19 nt) dan persyaratan sekuens PAM. Namun, skrining CRISPR terbatas pada gen pengkode protein, sedangkan skrining shRNA dapat menargetkan RNA non-kode.
