Kriopreservasi adalah proses mengawetkan sel hidup, jaringan, atau mikroorganisme pada suhu ultra-rendah (biasanya −80 °C atau −196 °C dalam nitrogen cair) sehingga tetap viabel untuk penggunaan di masa depan. Bank sel yang dikelola dengan baik memastikan reprodusibilitas eksperimental selama bertahun-tahun.

Prinsip

Pembentukan kristal es adalah penyebab utama kematian sel selama pembekuan. Es intraseluler merobek membran dan mengganggu organel. Agen krioprotektif (CPA) melindungi sel dengan:

• Menembus sel (misalnya, DMSO, gliserol) untuk menggantikan air dan menurunkan titik beku.
• Tidak menembus (misalnya, sukrosa, Ficoll) untuk dehidrasi sel sebelum pembekuan.

Laju pendinginan harus menyeimbangkan dua efek yang bersaing: terlalu lambat menyebabkan kerusakan osmotik dari paparan berkepanjangan terhadap zat terlarut pekat; terlalu cepat menyebabkan es intraseluler yang mematikan. Sebagian besar sel mamalia didinginkan secara optimal pada −1 °C per menit.

Krioprotektan

• DMSO (dimetil sulfoksida): CPA yang paling banyak digunakan. Konsentrasi tipikal adalah 5–10% (v/v) dalam medium kultur dengan 10–20% FBS atau medium pembekuan bebas serum. DMSO bersifat toksik bagi sel pada suhu ruang seiring waktu — bekerjalah dengan cepat dan pertahankan sel di atas es.
• Gliserol: 10–20% (v/v). Kurang toksik daripada DMSO tetapi kurang menembus. Umumnya digunakan untuk bakteri, ragi, dan beberapa garis sel.
• Media pembekuan bebas serum: formulasi komersial (misalnya, CryoStor, Recovery Cell Culture Freezing Medium) menggunakan CPA terdefinisi tanpa serum hewan.

Protokol Pembekuan

1. Panen sel pada fase log dengan viabilitas >90%.
2. Hitung dan sentrifugasi pada 200–300 × g selama 5 menit.
3. Resuspensi dalam medium pembekuan dingin pada 1–5 × 10⁶ sel/mL.
4. Bagikan ke dalam cryovial (1 mL per vial). Beri label dengan garis sel, nomor pasase, tanggal, dan operator.
5. Dinginkan pada −1 °C/menit menggunakan freezer dengan laju terkendali, wadah pembekuan isopropanol (Mr. Frosty), atau alat pendingin pasif.
6. Pindahkan ke −80 °C selama 24 jam (jangka pendek), lalu pindahkan ke nitrogen cair (−196 °C) untuk penyimpanan jangka panjang.

Protokol Pencairan

1. Keluarkan vial dari penyimpanan dan segera tempatkan dalam penangas air 37 °C dengan agitasi lembut.
2. Cairkan sampai hanya kristal es kecil yang tersisa (sekitar 1–2 menit).
3. Lap vial dengan etanol 70%.
4. Pindahkan isi tetes demi tetes ke dalam 10 mL medium kultur yang telah dihangatkan.
5. Sentrifugasi pada 200 × g selama 5 menit untuk menghilangkan DMSO, resuspensi dalam medium segar, dan tanam.

Kriopreservasi Bakteri dan Ragi

Bakteri dan ragi lebih sederhana untuk diawetkan. Campur kultur semalaman 1:1 dengan gliserol steril 50% dalam cryovial, vortex, dan bekukan pada −80 °C. Untuk pemulihan, gores permukaan stok beku dengan loop steril dan streak ke plat agar — jangan mencairkan seluruh stok.

Praktik Bank Sel yang Baik

• Buat Master Cell Bank (MCB) pada nomor pasase serendah mungkin, kemudian turunkan Working Cell Banks (WCB) dari MCB.
• Uji MCB untuk mikoplasma, kontaminasi bakteri, dan identitas (profil STR untuk garis sel manusia).
• Simpan vial MCB di dua lokasi yang terpisah secara fisik.
• Pantau level nitrogen cair dan pertahankan catatan suhu.