Protein yang dimurnikan jarang berada dalam buffer yang tepat untuk langkah berikutnya — baik itu kristalisasi, uji aktivitas, atau formulasi. Dialisis, ultrafiltrasi, dan kolom desalting adalah alat standar untuk pertukaran buffer.

Dialisis

Dialisis menggunakan membran semi-permeabel dengan batas berat molekul (MWCO) yang ditentukan untuk memisahkan molekul kecil dari yang lebih besar. Sampel protein disegel di dalam tabung dialisis dan ditempatkan dalam volume besar buffer yang diinginkan. Molekul kecil (garam, agen pereduksi, denaturan) berdifusi melintasi membran ke dalam dialisat hingga kesetimbangan tercapai.

Pemilihan MWCO: pilih membran dengan ukuran pori yang kurang dari setengah berat molekul protein untuk memastikan retensi lengkap. Nilai MWCO standar adalah 3,5, 6–8, 10, dan 14 kDa. Untuk sebagian besar protein, MWCO 6–8 kDa atau 10 kDa sesuai.

Protokol:

1. Basahi membran dialisis dalam air suling atau buffer selama 30 menit.
2. Bilas dengan buffer dialisis.
3. Muat sampel ke dalam tabung, sisakan ruang udara untuk perubahan volume.
4. Segel dengan klip dan tempatkan dalam 100–200 volume buffer.
5. Aduk lembut pada 4 °C. Ganti buffer 2–3 kali selama 12–24 jam.
6. Ambil sampel — mungkin sedikit encer karena efek osmotik.

Kaset Slide-A-Lyzer (Thermo) menggunakan bingkai plastik kaku dengan membran terintegrasi, menghilangkan kebutuhan manipulasi tabung. Mereka mengapung di buffer dan lebih mudah ditangani untuk volume kecil.

Ultrafiltrasi (Konsentrator Sentrifugal)

Konsentrator sentrifugal (Amicon Ultra, Vivaspin) menggabungkan filtrasi dengan sentrifugasi. Membran di dasar reservoir sampel memungkinkan air dan zat terlarut kecil melewatinya sambil menahan protein di atas membran. Sentrifugasi pada 3000–5000 × g memaksa cairan melalui membran.

Konsentrasi: volume sampel dikurangi dengan membuang filtrat. Proses dalam putaran pendek (5–10 menit) untuk menghindari konsentrasi berlebih, yang dapat menyebabkan presipitasi. Pantau volume retentat dengan tanda pada perangkat.

Pertukaran buffer dengan diafiltrasi: alih-alih memekatkan hingga kering, tambahkan buffer baru ke retentat dan sentrifugasi lagi. Ulangi 3–5 kali; setiap siklus menukar sekitar 90% buffer. Lima siklus mencapai pertukaran >99,99%.

Pemilihan MWCO: seperti dialisis, pilih MWCO setidaknya 2× lebih kecil dari protein. Tidak seperti dialisis, peringkat MWCO untuk konsentrator didasarkan pada retensi protein globular — polimer linier dan beberapa deterjen mungkin melewati membran yang secara nominal retentif.

Kolom Desalting (Eksklusi Ukuran)

Kolom desalting (PD-10, Zeba Spin, NAP-5) menggunakan kromatografi eksklusi ukuran (SEC) dengan kolom manik kecil. Sampel diterapkan ke kolom, dan molekul besar (protein) terelusi dalam volume kosong, di depan molekul kecil (garam, nukleotida, agen pereduksi). Protein dikumpulkan dalam buffer baru tanpa pengenceran (PD-10) atau dengan pengenceran minimal (Zeba).

Desalting lebih cepat daripada dialisis (5–15 menit vs. jam) tetapi terbatas pada volume sampel yang sesuai untuk ukuran kolom (biasanya 0,5–2,5 mL). Untuk volume yang lebih besar, dialisis atau filtrasi aliran tangensial digunakan.