Mengkuantifikasi DNA dan RNA secara akurat adalah prasyarat untuk biologi molekuler yang reprodusibel. Dua pendekatan utama mendominasi: spektrofotometri dan fluorometri.
Spektrofotometri UV (NanoDrop)
Spektrofotometer NanoDrop mengukur 1–2 µL sampel yang ditempatkan langsung di atas pedestal, menggunakan tegangan permukaan untuk menciptakan panjang jalur yang ditentukan (0,2–1,0 mm). Ini mengukur absorbansi pada 230, 260, dan 280 nm:
- A₂₆₀ mengukur konsentrasi asam nukleat. Untuk dsDNA, 1 OD₂₆₀ = 50 ng/µL; untuk RNA, 1 OD₂₆₀ = 40 ng/µL; untuk ssDNA, 1 OD₂₆₀ = 33 ng/µL.
- A₂₈₀ mengukur kontaminasi protein dan fenol. Sampel DNA murni memiliki rasio A₂₆₀/A₂₈₀ ~1,8; RNA murni ~2,0.
- A₂₃₀ mengukur senyawa organik, garam kaotropik, dan fenol. Rasio A₂₆₀/A₂₃₀ harus ~2,0–2,2 untuk asam nukleat murni.
NanoDrop cepat dan memerlukan sampel minimal tetapi tidak dapat membedakan DNA dari RNA dan dipengaruhi oleh nukleotida, fragmen untai tunggal, dan kontaminan penyerap UV lainnya.
Kuantifikasi Fluorometrik (Qubit)
Fluorometer Qubit menggunakan pewarna fluoresen yang berikatan secara spesifik dengan dsDNA, RNA, atau protein. Ketika terikat, pewarna berpendar kuat, dan intensitas fluoresensi sebanding dengan konsentrasi.
Uji Qubit sangat selektif — uji dsDNA tidak mendeteksi ssDNA atau RNA, dan uji RNA tidak mendeteksi DNA. Mereka juga lebih sensitif daripada spektrofotometri, mendeteksi konsentrasi serendah 0,1 ng/µL. Trade-off adalah biaya per uji (reagen berbasis pewarna) dan kebutuhan dua standar kalibrasi per uji.
Memilih Metode
Gunakan spektrofotometri untuk kuantifikasi rutin DNA plasmid murni, produk PCR tanpa kontaminasi protein, dan memeriksa rasio kemurnian. Gunakan fluorometri untuk sampel berharga (persiapan perpustakaan NGS, DNA ChIP), ketika sampel mengandung nukleotida atau fragmen terdegradasi, atau ketika Anda perlu mengkuantifikasi dsDNA secara spesifik dengan adanya RNA.
Kuantifikasi Gel Agarosa
Untuk penilaian semi-kuantitatif, jalankan sampel pada gel agarosa bersama ladder dengan intensitas pita yang diketahui (misalnya, 100 ng, 50 ng, 25 ng). Intensitas fluoresensi etidium bromida atau SYBR Safe berkorelasi kasar dengan massa. Sistem pencitraan gel digital dapat mengintegrasikan intensitas pita untuk perkiraan, tetapi metode ini kurang akurat dibandingkan spektrofotometri atau fluorometri.
