Ikhtisar

Epigenomics adalah studi genom mengenai modifikasi epigenetik - perubahan kimia pada DNA dan kromatin yang mengatur ekspresi gen tanpa mengubah urutan DNA yang mendasarinya. Modifikasi ini termasuk metilasi DNA pada dinukleotida CpG, modifikasi histon pasca-translasi (seperti asetilasi, metilasi, dan fosforilasi), dan pola aksesibilitas kromatin. Peta epigenomik bervariasi antar tipe sel, tahap perkembangan, dan kondisi penyakit, sehingga memberikan lapisan informasi dinamis yang melengkapi genom statis. Proyek berskala besar seperti konsorsium ENCODE dan Roadmap Epigenomics telah menghasilkan atlas epigenomik yang komprehensif untuk ratusan jenis sel manusia.

Metode

Pembuatan profil epigenomik bergantung pada teknik yang diadaptasi untuk pengurutan throughput tinggi. Sekuensing bisulfit seluruh genom (WGBS) mengubah sitosin yang tidak termetilasi menjadi urasil, sehingga memungkinkan peta metilasi resolusi basa tunggal. ChIP-seq menggunakan antibodi untuk melakukan imunopresipitasi pada modifikasi histone spesifik atau wilayah yang terikat faktor transkripsi, diikuti dengan pengurutan. ATAC-seq dan DNase-seq memetakan wilayah kromatin terbuka untuk mengidentifikasi elemen pengatur aktif. Hi-C dan metode terkait menangkap konformasi kromatin tiga dimensi. Saluran pipa bioinformatika memproses pembacaan mentah melalui penyelarasan, pemanggilan puncak (menggunakan MACS2 atau PeakDene), dan analisis pengayaan diferensial. Analisis integratif yang menggabungkan beberapa jalur epigenomik mengungkapkan keadaan kromatin – seperti promotor aktif, peningkat, dan daerah yang ditekan – menggunakan alat seperti ChromHMM.

Aplikasi

Epigenomics telah mengubah pemahaman kita tentang perkembangan, penuaan, dan penyakit. Pola metilasi DNA yang menyimpang merupakan ciri khas kanker, dengan pembungkaman gen penekan tumor oleh hipermetilasi promotor kini menjadi target terapi. Pembuatan profil epigenomik memandu penemuan peningkat dan elemen regulasi lainnya yang dipelajari di regulasi gen dan epigenetika. Teknik ini berkaitan erat dengan chromatin immunoprecipitation (ChIP) namun diperluas ke seluruh genom. Epigenomics juga menjelaskan bagaimana waktu replikasi DNA berkorelasi dengan keadaan kromatin, dan bagaimana paparan lingkungan meninggalkan tanda epigenetik abadi yang memengaruhi hasil kesehatan sepanjang masa hidup.

Protokol Praktis

Untuk pengurutan bisulfit seluruh genom (WGBS), mulailah dengan 100–500 ng DNA genom yang dibubuhi 0,5% DNA fag lambda yang tidak termetilasi sebagai kontrol konversi. Fragmen DNA dengan sonikasi hingga 200–400 bp, kemudian lakukan perbaikan akhir, A-tailing, dan ligasi adaptor. Rawat dengan natrium bisulfit menggunakan EZ DNA Methylation-Gold Kit, yang mengubah sitosin yang tidak termetilasi menjadi urasil sambil membiarkan sitosin yang termetilasi tetap utuh. Amplifikasi PCR (12 siklus) dengan polimerase toleran urasil (misalnya, PfuTurbo Cx) dan urutan berpasangan ujung 150 bp. Sejajarkan bacaan dengan Bismark: bismark --genome genome_dir -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o bismark_output. Hapus duplikat bacaan dengan deduplication_bismark. Ekstrak panggilan metilasi: bismark_methylation_extractor --gzip --bedGraph --counts --buffer_size 10G bismark_output.bam. Outputnya mencakup persentase metilasi per-CpG dalam file laporan bedGraph atau CX. Untuk analisis metilasi diferensial, gunakan methylKit di R: methRead untuk mengimpor file cakupan, calculateDiffMeth untuk mengidentifikasi sitosin atau wilayah yang termetilasi secara berbeda dengan nilai q < 0,05 dan perbedaan metilasi > 25%. Untuk analisis modifikasi histone ChIP-seq ENCODE, proses pembacaan mentah melalui pipeline ENCODE: sejajarkan dengan Bowtie2, filter duplikat, panggil puncak dengan MACS2 menggunakan mode --broad untuk H3K27me3 atau H3K36me3, dan buat trek sinyal dengan bedClip dan bedGraphToBigWig. Segmentasi keadaan kromatin dengan ChromHMM menggabungkan beberapa tanda histone (H3K4me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K36me3, H3K27me3) ke dalam model kombinatorial: java -jar ChromHMM.jar LearnModel -b 200 binarized_beds output_dir 15 hg38. Model 15 negara mengelompokkan genom menjadi promotor aktif, peningkat, wilayah transkripsi, domain Polycomb yang ditekan, dan heterokromatin.