Fluorescence in situ hybridization menggunakan probe DNA berlabel fluoresen untuk mendeteksi dan melokalisasi sekuens DNA spesifik pada kromosom metafase dan dalam inti interfase, memungkinkan visualisasi langsung organisasi genomik dan kelainan.
Prinsip
FISH mengikuti prinsip hibridisasi yang sama dengan hibridisasi in situ kolorimetrik tetapi menggunakan probe terkonjugasi fluorofor untuk deteksi langsung tanpa amplifikasi enzimatik. Sinyal fluoresen divisualisasikan melalui mikroskop epifluoresen atau konfokal. Beberapa probe dengan fluorofor berbeda dapat diaplikasikan secara simultan, memungkinkan analisis multiwarna dari beberapa lokus genomik dalam satu spesimen.
Jenis Probe
Probe spesifik-lokus menargetkan daerah genomik unik, biasanya 50–500 kb yang dikloning ke dalam BAC atau fosmid. Probe ini diberi label melalui nick translation dengan nukleotida fluoresen seperti SpectrumOrange, SpectrumGreen, atau Cy5. Probe sentromer menargetkan sekuens ulangan alfa-satelit dan mengidentifikasi kromosom spesifik. Probe telomer memberi label ujung kromosom. Probe pewarnaan seluruh kromosom adalah campuran kompleks sekuens unik untuk satu kromosom, dihasilkan melalui flow sorting atau mikrodiseksi. Set probe berbasis oligonukleotida yang disintesis pada microarray kini menawarkan cakupan resolusi tinggi yang dapat disesuaikan.
Metode Pelabelan
Pelabelan langsung menggabungkan nukleotida terkonjugasi fluorofor selama sintesis probe. Deteksi segera setelah hibridisasi. Pelabelan tidak langsung menggabungkan hapten seperti digoksigenin atau biotin, yang dideteksi setelah hibridisasi dengan antibodi terkonjugasi fluorofor atau streptavidin. Metode tidak langsung memberikan amplifikasi sinyal melalui lapisan antibodi dan berguna untuk target kecil. Amplifikasi sinyal tyramide lebih meningkatkan sensitivitas.
Persiapan Sampel
Sediaan kromosom metafase dibuat dari kultur sel yang dihentikan dengan colcemid, dikembangkan secara hipotonik, dan difiksasi dalam metanol:asam asetat (3:1). Inti interfase diperoleh dari sel tidak berkultur atau jaringan terfiksasi. Spesimen di-age, diolah dengan RNase dan pepsin untuk mengurangi latar belakang, dan dehidrasi melalui seri etanol. Denaturasi DNA target dalam 70% formamida pada 72 °C diperlukan untuk probe untai ganda. Protokol bebas formamida menggunakan denaturasi panas dalam buffer hibridisasi adalah alternatif.
Hibridisasi dan Pencucian
Probe dan target didenaturasi bersama pada 75 °C selama 5 menit, kemudian dihibridisasi pada 37 °C selama 4–16 jam dalam ruang lembab. Pencucian pasca-hibridisasi dalam SSC dan Tween-20 menghilangkan probe yang tidak terikat. Stringensi dikendalikan oleh konsentrasi formamida, suhu pencucian, dan konsentrasi garam. Setelah pencucian, slide diberi kontras dengan DAPI, yang menghasilkan pola Q-banding pada kromosom metafase untuk identifikasi kariotipe.
FISH Multiwarna
Multiplex FISH (M-FISH) menggunakan kombinasi lima fluorofor dalam skema pelabelan kombinatorial untuk menghasilkan 24 set probe spesifik kromosom, masing-masing dengan tanda spektral unik. Kariotipe spektral menggunakan pendekatan serupa dengan spektrometri pencitraan. Teknik-teknik ini memungkinkan analisis kariotipe komprehensif dalam satu eksperimen, mendeteksi penataan ulang kompleks, kromosom penanda, dan translokasi kriptik.
Aplikasi
FISH adalah andalan klinis untuk mendeteksi aneuploidi kromosom dalam diagnosis prenatal menggunakan amniosit tidak berkultur dan sampel vilus korionik. Status amplifikasi gen HER2 pada kanker payudara dinilai secara rutin dengan FISH. Deteksi fusi BCR-ABL pada leukemia myeloid kronis menggunakan probe fusi dual-warna, dual-fusi pada inti interfase. Kromosom Philadelphia t(9;22) muncul sebagai sinyal fusi. FISH pada irisan jaringan terfiksasi formalin dan terembedded parafin memetakan perubahan genomik pada tumor padat. Cat kromosom-spesifik sangat penting dalam biologi radiasi untuk mengukur kerusakan dan perbaikan DNA melalui uji mikronukleus dan translokasi.
