Ikhtisar
Genomik fungsional bertujuan untuk menutup kesenjangan antara urutan genom dan fungsi biologis dengan mengkarakterisasi secara sistematis peran gen, produknya, dan interaksinya pada skala genom yang luas. Sementara genomik struktural memberikan cetak biru statis DNA suatu organisme, genomik fungsional menanyakan apa yang dilakukan setiap elemen, kapan dan di mana ia aktif, dan bagaimana ia berpartisipasi dalam jaringan seluler. Bidang ini mengintegrasikan data dari transkriptomik, proteomik, dan layar gangguan throughput tinggi untuk menetapkan fungsi biologis pada setiap gen. Perspektif tingkat sistem ini menjadi penting untuk memahami fenotip yang kompleks.
Metode
Beberapa pendekatan throughput tinggi mendukung genomik fungsional. Layar kehilangan fungsi menggunakan interferensi RNA (RNAi) atau pustaka CRISPR-Cas9 untuk memusnahkan gen secara sistematis dan mengamati konsekuensi fenotipik. Layar peningkatan fungsi mengekspresi pustaka cDNA secara berlebihan untuk mengidentifikasi gen yang mendorong fenotip tertentu. Pemetaan interaksi protein (melalui dua hibrida ragi atau spektrometri massa pemurnian afinitas) membangun jaringan interaksi seluruh genom. Pembuatan profil ekspresi gen menggunakan RNA-seq atau microarray mengungkap pola ekspresi bersama yang menunjukkan hubungan fungsional. Integrasi beragam tipe data melalui pembelajaran mesin memprediksi fungsi gen dengan akurasi yang meningkat, memberikan anotasi seperti istilah Gene Ontology berdasarkan bukti multi-omics.
Aplikasi
Genomik fungsional mendorong penemuan di semua bidang kehidupan. Dalam penelitian kanker, pemeriksaan CRISPR mengidentifikasi gen yang penting untuk pertumbuhan tumor dan gen yang kehilangannya menyebabkan resistensi obat. Dalam mikrobiologi, uji kebugaran seluruh genom menentukan gen yang diperlukan untuk patogenesis. Aplikasi pertanian mencakup identifikasi gen yang mengendalikan hasil, toleransi terhadap stres, dan kandungan nutrisi melalui gabungan teknologi DNA rekombinan dan penyaringan fungsional. Bidang ini terus berkembang dengan teknologi sel tunggal dan layar CRISPR in vivo yang mengungkap fungsi gen dalam konteks jaringan asli, membawa kita lebih dekat pada anotasi fungsional genom yang lengkap.
Protokol Praktis
Untuk percobaan ChIP-seq untuk mengidentifikasi situs pengikatan faktor transkripsi, mulailah dengan pengikatan silang sel menggunakan formaldehida 1% selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian padamkan dengan glisin. Kromatin dipotong menjadi fragmen 200–600 bp melalui sonikasi (misalnya, Covaris atau Diagenode Bioruptor). Imunopresipitasi menggunakan 2–5 µg antibodi spesifik target yang digabungkan dengan manik magnetik Protein A/G semalaman pada suhu 4°C. Setelah dicuci, ikatan silang balik pada suhu 65°C selama 6 jam dengan proteinase K, kemudian murnikan DNA dengan pembersihan kolom. Perpustakaan dipersiapkan dengan perbaikan akhir, A-tailing, ligasi adaptor, dan 12–15 siklus PCR. Urutan di Illumina dengan pembacaan 50 bp ujung tunggal. Jalankan pipa ENCODE ATAC-seq untuk pembuatan profil kromatin terbuka pada sel beku atau segar: inti diisolasi dengan inkubasi buffer lisis, kemudian diberi tag dengan transposase Tn5 pada suhu 37°C selama 30 menit: tagment --input 50.000 sel --output tagmented.bam. Amplifikasi PCR dengan primer berkode batang selama 8-12 siklus dan urutan berpasangan. Untuk analisis data, sejajarkan pembacaan dengan Bowtie2 menggunakan --very-sensitive untuk ATAC-seq atau BWA untuk ChIP-seq. Hapus duplikat dengan Picard MarkDuplikat. Panggilan puncak dengan MACS2: macs2 callpeak -t aligned.bam -c input.bam -f BAMPE -g hs -n sample -q 0.05. Untuk tanda histone seperti H3K4me3, gunakan mode puncak lebar dengan --broad. Metrik kualitas mencakup fraksi pembacaan dalam puncak (FRiP > 1% untuk faktor transkripsi, >10% untuk tanda histone), NSC (koefisien untai ternormalisasi >1,05), dan RSC (korelasi untai relatif >0,8). Analisis pengikatan diferensial antar kondisi menggunakan DiffBind di R, dan pengayaan motif diuji dengan HOMER atau MEME-ChIP.
