Seiring meningkatnya kompleksitas konstruk biologi sintetis, kloning restriksi tradisional menjadi tidak praktis. Gibson Assembly dan kloning Golden Gate memungkinkan perakitan multi-fragmen dalam satu reaksi satu-tabung.
Gibson Assembly
Gibson Assembly menggabungkan beberapa fragmen DNA dengan ujung yang tumpang tindih dalam satu reaksi isotermal pada 50 °C. Campuran reaksi mengandung tiga aktivitas enzimatik:
- 5’ eksonuklease (T5 exonuclease atau RecE): mengunyah ujung 5’ DNA untai ganda, meninggalkan overhang 3’ untai tunggal yang memungkinkan fragmen komplementer untuk beranil.
- DNA polimerase (Phusion atau Taq): mengisi celah yang tersisa setelah anilasi.
- DNA ligase (Taq ligase): menutup nick pada DNA yang telah dirakit.
Setiap fragmen harus memiliki homologi 15–40 bp dengan tetangganya di persimpangan. Tumpang tindih ini ditambahkan oleh primer PCR. Gibson Assembly dapat menggabungkan 2–15 fragmen secara simultan. Perakitan tanpa bekas — tidak ada situs restriksi yang tersisa di produk akhir.
Reaksi memerlukan 50–100 ng setiap fragmen dalam jumlah ekuimolar dan selesai dalam 15–60 menit pada 50 °C. Produk ditransformasikan langsung ke E. coli kompeten kimiawi. Gibson Assembly ideal untuk:
- Merakit gen sintetis dari oligonukleotida.
- Membangun plasmid lengkap dari fragmen yang tumpang tindih.
- Mengonstruksi kaset rekayasa genom dengan lengan homologi.
- Membuat pustaka DNA untuk evolusi terarah.
Kloning Golden Gate
Kloning Golden Gate menggunakan enzim restriksi Tipe IIS (BsaI, BpiI, Esp3I) yang memotong di luar sekuens pengenalannya, menghasilkan overhang untai tunggal 4 bp yang terdefinisi. Overhang ini dapat ditentukan oleh pengguna.
Reaksi adalah digesti-ligasi simultan: enzim Tipe IIS dan T4 DNA ligase ditambahkan bersama dalam satu tabung, dan campuran reaksi disikluskan antara suhu optimal enzim (37 °C untuk BsaI) dan 16 °C atau 37 °C (untuk ligasi). Karena situs pengenalan dihilangkan dari produk rakitan akhir, reaksi didorong hingga selesai — produk rakitan tidak dapat dicerna kembali.
Golden Gate adalah dasar dari standar kloning modular seperti MoClo, Golden Braid, dan Plant Toolbox. Ini ideal untuk:
- Perakitan kombinatorial bagian genetik (promotor, UTR 5’, CDS, terminator, tag).
- Membangun array TALEN dari modul repeat individu.
- Mengonstruksi pustaka sgRNA terkumpul untuk skrining CRISPR.
Overhang dirancang agar saling kompatibel dalam urutan yang ditentukan, memungkinkan vektor yang sama menerima kombinasi bagian yang berbeda. Golden Gate lebih skalabel daripada Gibson Assembly untuk proyek kombinatorial modular, meskipun memerlukan fragmen tanpa situs pengenalan internal untuk enzim yang digunakan.
