Kromatografi interaksi hidrofobik memisahkan protein berdasarkan perbedaan hidrofobisitas permukaan. Protein dimuat dalam kondisi garam tinggi yang mendorong interaksi hidrofobik dengan fase diam dan dielusi dengan menurunkan konsentrasi garam, yang melemahkan efek hidrofobik.
Prinsip
Pada konsentrasi garam tinggi, molekul air diatur di sekitar ion garam (efek salting-out), mengurangi ketersediaan air untuk melarutkan tambalan hidrofobik pada permukaan protein. Ini memaksa daerah hidrofobik pada protein untuk berinteraksi dengan ligan hidrofobik yang diimobilisasi pada media kromatografi. Ketika konsentrasi garam dikurangi selama elusi, air menjadi lebih tersedia, interaksi hidrofobik melemah, dan protein terelusi dalam urutan peningkatan hidrofobisitas permukaan. Pengikatan tergantung pada jenis dan konsentrasi garam, dengan amonium sulfat, natrium sulfat, dan NaCl menjadi pilihan umum yang diatur dalam deret Hofmeister berdasarkan kekuatan salting-out mereka.
Selektivitas dan Resolusi
Selektivitas HIC ortogonal terhadap kromatografi pertukaran ion dan kromatografi eksklusi ukuran. Resolusi tergantung pada jenis ligan (alkil — butil, oktil, fenil), kepadatan ligan, kemiringan gradien garam, dan suhu. Gradien linier 10–20 volume kolom biasanya memberikan resolusi terbaik. Elusi langkah digunakan untuk penangkapan skala proses. Ligan fenil menawarkan interaksi hidrofobik dan aromatik, memberikan selektivitas yang berbeda dari ligan alkil rantai lurus.
Media Kolom
Resin HIC umum meliputi butil- dan oktil-Sepharose (GE Healthcare), Phenil dan Butil Toyopearl (Tosoh), dan pendukung Macro-Prep t-Butil dan Metil HIC (Bio-Rad). Resin bervariasi dalam hidrofobisitas: butil > oktil untuk rantai alkil pada kepadatan setara. Ukuran partikel 30–100 µm menyeimbangkan resolusi dan sifat aliran untuk kerja preparatif.
Pertimbangan Buffer
Buffer pemuatan mengandung 1–2 M amonium sulfat atau 3–4 M NaCl. Elusi menggunakan buffer yang sama tanpa garam. Menurunkan pH atau menyertakan etilen glikol lebih lanjut mengurangi interaksi hidrofobik untuk protein yang terikat erat. Deterjen harus dihindari karena mengganggu pengikatan hidrofobik. Sampel sering disesuaikan secara langsung dengan menambahkan garam padat atau dengan mengencerkan dengan larutan stok garam pekat.
Pengembangan Metode
Mulai dengan kolom saringan kecil (1 mL) yang menguji dua atau tiga kimia resin pada dua konsentrasi garam. Muat 5–10 mg protein per mL resin. Cuci dengan 5 volume kolom buffer pemuatan. Elusi dengan gradien linier 10 volume kolom ke nol garam. Kumpulkan fraksi 1 mL dan analisis dengan SDS-PAGE. Optimalkan kemiringan gradien untuk pemisahan target.
Aplikasi
HIC banyak digunakan dalam manufaktur biofarmasi sebagai langkah pemurnian antara atau pemolesan. Ini secara efektif menghilangkan agregat, isoform terpotong, dan protein sel inang setelah langkah penangkapan seperti Protein A atau IMAC. HIC sangat efektif untuk menghilangkan kontaminan hidrofobik termasuk endotoksin, protein terikat DNA, dan partikel virus. Ini biasanya digabungkan dengan sistem FPLC untuk eksekusi metode otomatis.
