Penyaringan throughput tinggi (HTS) adalah proses otomatis yang menguji sejumlah besar senyawa terhadap target biologis untuk mengidentifikasi titik awal penemuan obat atau penelitian biologi kimia. Kampanye HTS yang dirancang dengan baik mengintegrasikan pengembangan uji, otomatisasi, analisis data, dan validasi hit.
Pengembangan Uji
Fundamental dari setiap kampanye HTS adalah uji yang kuat dan reprodusibel. Uji harus mengukur aktivitas biologis spesifik dalam format yang cocok untuk otomatisasi dan miniaturisasi. Uji biokimia menggunakan protein yang dimurnikan untuk mengukur inhibisi enzim, pengikatan reseptor, atau interaksi protein-protein. Uji berbasis sel mengukur viabilitas, ekspresi gen reporter, atau perubahan fenotipik.
Parameter kunci dalam pengembangan uji meliputi rasio signal-to-noise, rasio signal-to-background, dan Z-factor, yang mengkuantifikasi kualitas uji untuk HTS. Z-factor di atas 0,5 menunjukkan uji yang sangat baik. Koefisien variasi harus rendah, biasanya di bawah 10%.
Miniaturisasi uji mengurangi konsumsi reagen dan meningkatkan throughput. Uji HTS modern dilakukan dalam plat 384-sumur atau 1536-sumur dengan volume total 5–50 µL. Uji homogen yang tidak memerlukan langkah pencucian lebih disukai untuk kecepatan dan kesederhanaan.
Teknologi Deteksi
Pembacaan berbasis fluoresensi adalah yang paling umum dalam HTS. Intensitas fluoresensi, polarisasi fluoresensi, fluorescence resonance energy transfer (FRET), dan time-resolved FRET (TR-FRET) banyak digunakan. Uji luminesensi, termasuk uji reporter berbasis firefly luciferase dan bioluminescence resonance energy transfer (BRET), menawarkan sensitivitas tinggi dan latar belakang rendah.
Teknologi AlphaScreen menggunakan kemiluminesensi berbasis manik dan sangat berguna untuk mendeteksi interaksi biomolekuler. Uji berbasis absorbansi sederhana dan kuat tetapi kurang sensitif. Pendekatan bebas label seperti surface plasmon resonance (SPR) dan spektrometri massa dapat mendeteksi pengikatan langsung tanpa label fluoresen.
Perpustakaan Senyawa
Perpustakaan HTS biasanya berisi ratusan ribu hingga jutaan senyawa. Perpustakaan keragaman bertujuan untuk mencakup ruang kimia yang luas, sementara perpustakaan terfokus menargetkan keluarga protein spesifik seperti kinase atau GPCR. Perpustakaan fragmen berisi senyawa dengan berat molekul rendah untuk penyaringan berbasis fragmen.
Kualitas perpustakaan dinilai dari kemurnian senyawa, stabilitas, dan sifat fisikokimia. Aturan lima Lipinski memandu sifat seperti obat: berat molekul di bawah 500 Da, logP di bawah 5, tidak lebih dari 5 donor ikatan hidrogen, dan tidak lebih dari 10 akseptor ikatan hidrogen. Pan-assay interference compounds (PAINS) ditandai sebagai frequent hitter yang menghasilkan positif palsu melalui mekanisme non-spesifik.
Otomatisasi dan Robotika
HTS bergantung pada sistem robotik terintegrasi yang menangani penyimpanan plat, dispensing cairan, inkubasi, pencucian, dan deteksi. Pencuci plat, pipet multi-saluran, dan acoustic droplet ejector memungkinkan penanganan cairan presisi pada volume nanoliter. Kontrol lingkungan mempertahankan suhu, kelembaban, dan kadar CO2 untuk uji berbasis sel.
Throughput penyaringan diukur dalam plat per hari atau senyawa per minggu. Kampanye HTS tipikal pada 100.000 senyawa dalam format 384-sumur memerlukan sekitar 260 plat. Platform ultra-HTS dapat menyaring lebih dari 1 juta senyawa per hari.
Analisis Data dan Pemilihan Hit
Data penyaringan primer dinormalisasi dan dikoreksi untuk variasi antar plat. Persen inhibisi atau aktivitas dihitung relatif terhadap kontrol positif dan negatif. Z-score mengukur jumlah deviasi standar dari rata-rata plat. Ambang pemilihan hit biasanya ditetapkan pada 3 deviasi standar di atas rata-rata atau pada batas persen inhibisi tertentu.
Konfirmasi hit melibatkan pengujian ulang dalam uji primer dan pengujian untuk aktivitas tergantung konsentrasi. Counter-screen menghilangkan senyawa yang mengganggu teknologi deteksi daripada target. Uji selektivitas menilai aktivitas terhadap target terkait. Senyawa promiscuous diidentifikasi oleh hubungan struktur-aktivitas yang datar dan aktivitas di beberapa uji yang tidak terkait.
Hit-to-Lead dan Optimasi Lead
Hit yang terkonfirmasi menjalani optimasi kimia obat untuk meningkatkan potensi, selektivitas, dan sifat seperti obat. Studi hubungan struktur-aktivitas (SAR) mengidentifikasi gugus fungsional kunci yang bertanggung jawab atas aktivitas. Profil ADME (absorpsi, distribusi, metabolisme, ekskresi) menilai sifat farmakokinetik. Studi kemanjuran in vivo pada model hewan memvalidasi potensi terapeutik dari lead yang dioptimalkan.
