Imunofluoresensi (IF) dan imunositokimia (ICC) adalah teknik berbasis antibodi yang mengungkapkan di mana suatu protein berada di dalam sel pada tingkat subseluler. IF menggunakan pewarna fluoresen; ICC menggunakan enzim kromogenik. Keduanya penting untuk biologi sel, patologi, dan penemuan obat.

Metode Langsung vs. Tidak Langsung

IF langsung: antibodi primer langsung dikonjugasi ke fluorofor. Cepat (satu inkubasi) dan latar belakang rendah, tetapi amplifikasi sinyal terbatas karena hanya satu antibodi yang berikatan per antigen.

IF tidak langsung: antibodi primer yang tidak terkonjugasi berikatan dengan target, dan antibodi sekunder yang terkonjugasi fluorofor berikatan dengan primer. Amplifikasi sinyal terjadi karena beberapa antibodi sekunder berikatan dengan setiap primer. Ini adalah pendekatan paling umum, karena bekerja dengan banyak antibodi primer dari spesies inang yang sama.

Persiapan Sampel

1. Fiksasi: mempertahankan struktur seluler dan mengimobilisasi antigen. Paraformaldehida (4% PFA, 15 menit pada suhu ruang) adalah fiksatif paling umum untuk IF. Ini mengikat silang protein melalui gugus amino. Fiksasi metanol/aseton lebih cepat tetapi dapat mendistorsi morfologi dan menghancurkan beberapa epitop.
2. Permeabilisasi: memungkinkan antibodi mengakses antigen intraseluler. Triton X-100 (0,1–0,5%) atau saponin (0,1%, lebih lembut) selama 10–15 menit. Lewati permeabilisasi jika hanya mewarnai antigen permukaan sel.
3. Blocking: inkubasi dengan 1–5% BSA, 5–10% serum normal (dari spesies inang antibodi sekunder), atau buffer blocking komersial selama 30–60 menit untuk mencegah pengikatan antibodi non-spesifik.
4. Antibodi primer: inkubasi dalam buffer blocking pada 4 °C semalaman atau suhu ruang selama 1–2 jam. Optimalkan pengenceran secara empiris.
5. Cuci: 3 × 5 menit dalam PBS.
6. Antibodi sekunder: inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang dalam gelap (fluorofor sensitif terhadap cahaya).
7. Cuci: 3 × 5 menit dalam PBS.
8. Counterstain dan mounting: DAPI atau Hoechst 33342 untuk mewarnai nuklei (5 menit). Mount dengan medium mounting anti-pudar.

Kontrol

• Kontrol tanpa antibodi primer: hanya antibodi sekunder — seharusnya tidak menunjukkan pewarnaan spesifik.
• Kontrol isotipe: antibodi primer diganti dengan antibodi non-spesifik dari isotipe yang sama.
• Kontrol peptida blocking: pre-inkubasi antibodi primer dengan peptida imunisasi untuk menghilangkan pewarnaan spesifik.
• Kontrol knockout: sel yang kekurangan protein target mengonfirmasi spesifisitas antibodi.

Multiplexing

Beberapa protein dapat dicitrakan secara simultan menggunakan antibodi primer yang dibesarkan di spesies inang yang berbeda (mencit, kelinci, kambing, tikus) dengan antibodi sekunder spesifik-spesies yang dikonjugasi ke fluorofor yang berbeda (DAPI (biru), Alexa 488 (hijau), Alexa 568 (merah), Alexa 647 (merah-jauh)). Unmixing spektral atau filter pita sempit mencegah bleed-through antar saluran.

Akuisisi Gambar

Gunakan mikroskop fluoresensi widefield untuk sampel atau bagian tipis, mikroskop confocal untuk sampel yang lebih tebal (pemotongan optik menghilangkan blur di luar fokus), dan mikroskop iluminasi terstruktur atau STED untuk pencitraan super-resolusi di bawah batas difraksi. Atur waktu eksposur terhadap kontrol tanpa primer untuk memastikan sinyal spesifik di atas latar belakang.