Asam amino mengandung gugus terionisasi yang memperoleh atau kehilangan proton bergantung pada pH lingkungannya. Memahami perilaku titrasi dan titik isoelektrik (pI) asam amino merupakan hal mendasar dalam kimia protein dan teknik pemisahan seperti pemfokusan isoelektrik, yang dalam format kapilernya (CIEF) memisahkan protein dan peptida berdasarkan pI-nya dengan resolusi yang sangat tinggi.

Gugus yang Dapat Terionisasi dalam Asam Amino

Grup Alfa-Karboksil

Setiap asam amino memiliki gugus alfa-karboksil dengan pKa sekitar 2,2. Pada nilai pH di bawah pKa ini, gugus tersebut terprotonasi (COOH). Pada nilai pH di atas, ia terdeprotonasi (COO-).

Grup Alfa-Amino

Setiap asam amino memiliki gugus alfa-amino dengan pKa sekitar 9,4. Pada nilai pH di bawah pKa ini, gugus tersebut terprotonasi (NH3+). Pada nilai pH di atas, ia terdeprotonasi (NH2).

Grup Rantai Samping yang Dapat Terionisasi

Tujuh asam amino memiliki gugus tambahan yang dapat terionisasi dalam rantai sampingnya: asam aspartat (pKa ~3,9), asam glutamat (pKa ~4,1), histidin (pKa ~6,0), sistein (pKa ~8,3), tirosin (pKa ~10,1), lisin (pKa ~10,5), dan arginin (pKa ~12,5).

Kurva Titrasi

Titrasi Asam Amino Sederhana

Ketika alanin (tidak ada rantai samping yang dapat terionisasi) dititrasi dengan basa, akan terlihat dua daerah penyangga. Pada pH rendah, ia terprotonasi penuh dengan muatan +1. Ketika basa ditambahkan, gugus karboksil pertama-tama kehilangan protonnya, menghasilkan zwitterion tanpa muatan bersih. Penambahan lebih lanjut mendeprotonasi gugus amino, menghasilkan muatan -1.

Titik Isoelektrik (pI)

Titik isoelektrik adalah pH dimana asam amino mempunyai muatan positif dan negatif yang sama, sehingga tidak ada muatan bersih. Untuk asam amino tanpa rantai samping yang dapat terionisasi, pI adalah rata-rata dari dua nilai pKa: pI = (pKa1 + pKa2) / 2.

pI untuk Asam Amino dengan Rantai Samping yang Dapat Terionisasi

Untuk asam amino asam (asam aspartat, asam glutamat), pI adalah rata-rata dari dua nilai pKa terendah. Untuk asam amino basa (lisin, arginin, histidin), pI adalah rata-rata dari dua nilai pKa tertinggi.

Aplikasi

PI sangat penting untuk pemurnian protein menggunakan pemfokusan isoelektrik, sebuah teknik yang memisahkan protein berdasarkan pI-nya dalam gradien pH. Dalam format kapiler (CIEF), protein difokuskan menjadi pita tajam dalam kapiler sempit dan dideteksi secara online, sehingga memungkinkan analisis varian muatan kuantitatif. Pada pI-nya, protein memiliki kelarutan minimal dan tidak bermigrasi dalam medan listrik.