Kalorimetri titrasi isotermal (ITC) adalah teknik bebas label yang secara langsung mengukur perubahan panas yang menyertai interaksi pengikatan. Ini adalah satu-satunya metode yang memberikan karakterisasi termodinamika lengkap dari pengikatan, termasuk konstanta asosiasi kesetimbangan (Ka), energi bebas Gibbs (ΔG), perubahan entalpi (ΔH), perubahan entropi (ΔS), dan stoikiometri pengikatan (n) dari satu eksperimen.
Dalam eksperimen ITC, larutan ligan disuntikkan dalam aliquot kecil ke dalam sel sampel yang mengandung makromolekul di bawah suhu konstan. Setiap injeksi menghasilkan pulsa panas saat molekul ligan mengikat target. Saat situs pengikatan menjadi jenuh, sinyal panas menurun hingga hanya panas pengenceran yang tersisa. Sel referensi hanya berisi buffer, dan instrumen mengukur daya diferensial yang diperlukan untuk mempertahankan suhu yang identik antara kedua sel.
Termogram yang dihasilkan memplot panas per injeksi terhadap waktu. Integrasi setiap puncak menghasilkan panas kumulatif yang dilepaskan atau diserap sebagai fungsi rasio molar ligan terhadap makromolekul. Regresi non-linear dari isoterm pengikatan menggunakan model pengikatan yang sesuai menghasilkan Ka, ΔH, dan n. ΔG dihitung dari Ka, dan ΔS diturunkan dari ΔG = ΔH - TΔS.
ITC dapat mengukur konstanta asosiasi dari 103 hingga 109 M−1. Batas deteksi tergantung pada besarnya entalpi pengikatan dan konsentrasi reaktan. Eksperimen tipikal memerlukan konsentrasi makromolekul 10–100 µM dalam sel dan konsentrasi ligan 10–100 kali lebih tinggi dalam jarum suntik.
Pertimbangan desain eksperimental meliputi pengoptimalan nilai-c (produk konsentrasi reseptor dan Ka), pemilihan volume injeksi, dan penentuan panas pengenceran dengan menyuntikkan ligan ke dalam buffer saja. Komposisi buffer, pH, dan suhu harus sesuai antara sampel dan referensi.
Aplikasi meliputi karakterisasi interaksi enzim-inhibitor, pengikatan protein-protein, interaksi protein-DNA, dan pengenalan antibodi-antigen. ITC juga mengukur kinetika enzim, interaksi protein membran, dan pembentukan korona protein-nanopartikel.
