Metode amplifikasi isothermal memperkuat asam nukleat pada suhu konstan, menghilangkan kebutuhan termal sikler. Mereka semakin banyak digunakan dalam diagnostik titik-perawatan, pengujian lapangan, dan pengaturan sumber daya terbatas.

Ikhtisar LAMP

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) menggunakan 4–6 primer yang mengenali 6–8 daerah berbeda pada urutan target. Reaksi dilakukan pada 60–65 °C menggunakan DNA polimerase dengan aktivitas strand-displacement (polimerase Bst dari Bacillus stearothermophilus). Polimerase terus-menerus memindahkan untai yang baru disintesis, menciptakan struktur loop yang berfungsi sebagai templat untuk amplifikasi lebih lanjut.

Hasilnya adalah amplifikasi eksponensial yang menghasilkan hingga 10⁹ salinan dalam waktu kurang dari satu jam. Karena set primer yang kompleks dan produk amplifikasi bercabang, LAMP sangat spesifik — ia dapat membedakan perbedaan nukleotida tunggal.

Desain Primer LAMP

Set primer LAMP meliputi:

• FIP (Forward Inner Primer): berisi urutan F2 dan F1c
• BIP (Backward Inner Primer): berisi urutan B2 dan B1c
• F3 dan B3 (primer luar): memulai strand displacement
• Opsional Primer Loop (LF dan LB): mempercepat reaksi dengan memprimer struktur loop

Desain primer sangat penting dan biasanya dilakukan dengan perangkat lunak khusus (PrimerExplorer, LAMP Designer). Daerah target harus 200–300 bp.

Metode Deteksi

Produk LAMP dapat dideteksi dengan:

• Kekeruhan: jumlah besar endapan magnesium pirofosfat yang terbentuk selama amplifikasi terlihat dengan mata telanjang.
• Pewarna kolorimetri: fenol merah atau hidroksinaftol biru berubah warna ketika pH reaksi berubah atau magnesium dikonsumsi.
• Fluoresensi: pewarna interkalasi (SYBR Green, EvaGreen) atau kalsein menghasilkan sinyal fluoresen.
• Aliran lateral: menggunakan primer berlabel yang menggabungkan hapten untuk deteksi strip imunokromatografi.

Metode Isothermal Lainnya

• RPA (Recombinase Polymerase Amplification): menggunakan rekombinase untuk memasangkan primer dengan DNA dupleks homolog, protein pengikat DNA untai tunggal untuk menstabilkan untai yang dipindahkan, dan polimerase pemindah untai. Beroperasi pada 37–42 °C dan menghasilkan produk terdeteksi dalam 5–20 menit. RPA adalah metode isothermal tercepat dan kompatibel dengan format beku-kering.
• HDA (Helicase-Dependent Amplification): menggunakan helikase DNA untuk membuka untai ganda alih-alih denaturasi panas, beroperasi pada 37–65 °C tergantung pada helikase.
• NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification): memperkuat target RNA pada 41 °C menggunakan tiga enzim (reverse transcriptase, RNase H, dan T7 RNA polimerase), menghasilkan amplikon RNA.

Aplikasi

Amplifikasi isothermal banyak digunakan untuk deteksi patogen (SARS-CoV-2, malaria, tuberkulosis, virus Zika), pengujian keamanan pangan, dan pemantauan lingkungan. Kemampuan untuk menjalankan reaksi dalam penangas air atau heat block dan mendeteksi hasil dengan perubahan warna menjadikannya ideal untuk pengujian terdesentralisasi.