Kloning enzim restriksi tradisional telah dilengkapi — dan di banyak laboratorium digantikan — oleh metode perakitan rekombinatorial dan modular yang lebih cepat, tanpa bekas, dan kompatibel dengan alur kerja throughput tinggi.
Gateway Cloning
Gateway cloning menggunakan sistem rekombinasi spesifik-situs dari bakteriofag lambda. Dua reaksi rekombinasi berurutan memindahkan urutan DNA yang diminati antar vektor tanpa enzim restriksi atau ligase.
Dalam reaksi BP, produk PCR yang diapit oleh situs attB bergabung dengan vektor donor yang mengandung situs attP, menciptakan entry clone. Reaksi LR kemudian mentransfer sisipan dari entry clone ke vektor tujuan mana pun yang mengandung situs attR. Vektor tujuan menyediakan elemen ekspresi yang sesuai untuk organisme target.
Gateway cloning bersifat directional, tidak mengubah kerangka baca, dan memungkinkan entry clone yang sama dipindahkan ke beberapa vektor tujuan (misalnya, untuk ekspresi di bakteri, sel mamalia, atau tanaman). Keterbatasan utamanya adalah ukuran situs rekombinasi (sekitar 50 bp masing-masing), yang menambahkan urutan ekstra ke konstruk akhir.
Gibson Assembly
Gibson Assembly menggabungkan beberapa fragmen DNA dalam satu reaksi isothermal (50 °C, 15–60 menit). Ini memerlukan tiga aktivitas enzimatik:
- 5′ exonuclease mengunyah kembali ujung 5′, meninggalkan overhang 3′ untai tunggal yang tumpang tindih.
- DNA polimerase mengisi celah.
- DNA ligase menutup nick.
Fragmen harus memiliki 15–40 bp urutan tumpang tindih di ujungnya, yang biasanya ditambahkan melalui primer PCR. Gibson Assembly dapat menggabungkan hingga 10–15 fragmen secara simultan dan ideal untuk merakit konstruk besar seperti gen sintetis, seluruh plasmid, atau kaset rekayasa genom. Perakitannya tanpa bekas — tidak ada situs restriksi yang tertinggal.
Golden Gate Cloning
Golden Gate cloning menggunakan enzim restriksi Tipe IIS, yang memotong di luar sekuens pengenalannya, menghasilkan overhang 4 bp yang ditentukan. Overhang ini dapat ditentukan oleh pengguna dan dirancang untuk menjadi unik dan kompatibel.
Reaksi adalah digest-ligasi satu pot: enzim Tipe IIS dan T4 DNA ligase ditambahkan bersama, dan reaksi disikluskan antara suhu optimal enzim dan 37 °C. Karena situs pengenalan dihilangkan setelah pemotongan, produk akhir yang dirakit tidak lagi dapat dicerna, mendorong reaksi hingga selesai.
Golden Gate adalah dasar dari sistem kloning modular seperti MoClo dan Plant Toolbox. Ini ideal untuk perakitan kombinatorial bagian genetik (promotor, urutan pengkode, terminator) dan untuk membangun array TALEN atau perpustakaan sgRNA.
