Native PAGE

Tidak seperti SDS-PAGE, native (non-denaturasi) PAGE memisahkan protein dalam konformasi alaminya tanpa SDS atau agen pereduksi. Laju migrasi tergantung pada ukuran protein dan muatan intrinsiknya, membuat estimasi berat molekul kurang langsung dibandingkan SDS-PAGE — tetapi mempertahankan aktivitas enzimatik dan interaksi protein–protein.

Buffer: Sistem yang paling umum adalah sistem buffer Laemmli tanpa SDS. Gel resolving pada pH 8,8 dan gel stacking pada pH 6,8, keduanya dengan buffer running Tris-glisin. Protein membawa muatan negatif bersih pada pH running dan bermigrasi menuju anoda.

Blue Native PAGE (BN-PAGE): Coomassie Blue G-250 ditambahkan ke buffer katoda dan sampel protein. Pewarna berikatan dengan permukaan hidrofobik, memberikan muatan negatif seragam tanpa mendenaturasi protein. Ini memungkinkan pemisahan kompleks protein membran (misalnya, superkompleks rantai pernapasan) yang tidak larut dalam kondisi native standar.

Aplikasi:

• Menentukan keadaan oligomerik protein (monomer, dimer, tetramer).
• Menganalisis kompleks multi-protein dengan Western blot atau spektrometri massa setelah digesti dalam gel (native-PAGE diikuti 2D SDS-PAGE).
• Mendeteksi isoform enzim dengan mobilitas elektroforetik yang berbeda.
• Kontrol kualitas untuk pemurnian protein (penilaian agregasi).

Keterbatasan: resolusi umumnya lebih rendah daripada SDS-PAGE. Protein asam dan basa bermigrasi buruk dalam sistem gel yang sama. Kalibrasi dengan penanda berat molekul native memberikan hanya perkiraan ukuran.

Zimografi

Zimografi mendeteksi aktivitas enzim langsung dalam gel poliakrilamida dengan mengko-polimerisasi substrat ke dalam gel resolving. Setelah elektroforesis, gel diinkubasi dalam buffer renaturasi untuk mengembalikan aktivitas enzim, kemudian diwarnai. Aktivitas enzim muncul sebagai pita jernih dengan latar belakang gelap di mana substrat telah terdegradasi.

Jenis zimografi:

• Zimografi gelatin: gelatin (kolagen terdenaturasi) dimasukkan pada 0,1%. Digunakan untuk matrix metalloproteinases (MMPs). Setelah inkubasi, gel diwarnai dengan Coomassie Blue — aktivitas MMP muncul sebagai pita putih/transparan dengan latar belakang biru.
• Zimografi kasein: kasein adalah substrat. Digunakan untuk protease serin dan aktivator plasminogen.
• Zimografi terbalik: gel mengandung substrat dan inhibitor. Aktivitas inhibitor muncul sebagai pita gelap di mana substrat dipertahankan terhadap degradasi.
• Uji kinase dalam gel: gel dipolimerisasi dengan substrat protein kinase, dan setelah elektroforesis, renaturasi, dan inkubasi dengan [γ-³²P]ATP, pita terfosforilasi dideteksi dengan autoradiografi.

Ringkasan protokol untuk zimografi gelatin:

1. Siapkan gel resolving dengan 0,1% gelatin (dan SDS).
2. Muat sampel dalam kondisi non-reduksi (tidak direbus, tidak ada agen pereduksi — ini mendenaturasi MMPs).
3. Jalankan pada 4 °C untuk mencegah proteolisis prematur.
4. Hapus SDS dengan mencuci gel dalam 2,5% Triton X-100 selama 30 menit (2 kali).
5. Inkubasi dalam buffer pengembangan (50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, 0,15 M NaCl, pH 7,5) pada 37 °C selama 16–48 jam.
6. Warnai dengan Coomassie Blue dan destain.

Zimografi sangat sensitif (mendeteksi jumlah pikogram enzim aktif) dan dapat membedakan antara bentuk pro-enzim (laten) dan aktif berdasarkan berat molekul.