Fosforilasi oksidatif adalah tahap akhir respirasi sel, yang terjadi di membran dalam mitokondria. Ia menggunakan energi yang dilepaskan oleh rantai transpor elektron untuk mendorong sintesis ATP, menghasilkan sebagian besar energi seluler.
Cara Kerja Fosforilasi Oksidatif
Rantai Transpor Elektron
NADH dan FADH2 dari glikolisis dan siklus asam sitrat menyumbangkan elektron ke kompleks protein yang tertanam di membran dalam mitokondria. Kompleks ini (Kompleks I hingga IV) melewatkan elektron melalui serangkaian reaksi redoks, masing-masing dengan potensi reduksi yang semakin tinggi.
Pemompaan Proton
Saat elektron bergerak melalui rantai, energi yang dilepaskan digunakan untuk memompa proton (H+) dari matriks mitokondria ke ruang antarmembran. Kompleks I, III, dan IV masing-masing berkontribusi dalam membangun gradien proton ini. Hasilnya adalah konsentrasi proton yang tinggi di ruang antar membran dan konsentrasi yang rendah di matriks.
Kekuatan Motif Proton
Gradien elektrokimia yang diciptakan oleh perbedaan konsentrasi proton dan potensial membran disebut gaya gerak proton. Gaya ini menyimpan energi potensial, seperti air di balik bendungan.
Sintesis ATP
Proton mengalir kembali ke matriks melalui ATP sintase (Kompleks V), turbin molekuler. Saat proton melewati enzim, ia berputar, mendorong fosforilasi ADP menjadi ATP. Sekitar tiga hingga empat molekul ATP diproduksi per sepuluh proton yang mengalir melaluinya.
Oksigen sebagai Akseptor Elektron Terminal
Oksigen adalah akseptor elektron terakhir di Kompleks IV. Ia menerima elektron dan bergabung dengan proton untuk membentuk air. Tanpa oksigen, rantai transpor elektron akan mundur dan fosforilasi oksidatif terhenti.
Hasil ATP
Oksidasi lengkap satu molekul glukosa menghasilkan sekitar 30-32 molekul ATP melalui fosforilasi oksidatif, jauh melebihi 2 ATP yang dihasilkan melalui glikolisis saja.
Pengukuran Praktis Tingkat Konsumsi Oksigen
Ukur tingkat konsumsi oksigen (OCR) menggunakan Seahorse XF Analyzer atau elektroda oksigen tipe Clark. Untuk pengujian Kuda Laut, sel benih pada sel 1–4 × 10⁴/sumur dalam pelat XF96, dikultur semalaman, kemudian ganti media dengan XF DMEM yang mengandung 10 mM glukosa dan 2 mM glutamin. Setimbang pada suhu 37°C selama 1 jam. Ukur OCR basal selama tiga siklus (3 menit pencampuran, 2 menit tunggu, 3 menit pengukuran). Suntikkan 1 µM oligomisin (Inhibitor Kompleks V) melalui port A - penurunan OCR menunjukkan fraksi yang digabungkan dengan sintesis ATP (respirasi terkait ATP). Suntikkan 0,5 µM FCCP (pelepasan) melalui port B — OCR mencapai maksimum (kapasitas pernafasan maksimal), dan kapasitas pernafasan cadangan dihitung sebagai (OCR maksimal − OCR basal). Suntikkan 0,5 µM rotenone (Inhibitor Kompleks I) ditambah 1 µM antimycin A (Inhibitor Kompleks III) melalui port C — OCR turun ke tingkat non-mitokondria, memastikan bahwa sinyal yang diukur berasal dari respirasi mitokondria. Untuk mitokondria terisolasi, gunakan elektroda Clark: tambahkan 0,5 mg mitokondria ke dalam 1 mL buffer respirasi (225 mM mannitol, 75 mM sukrosa, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,2, 5 mM KH2PO4, 0,1% BSA) dengan 5 mM suksinat atau 5 mM piruvat ditambah 2 mM malat sebagai substrat. Respirasi keadaan 3 (stimulasi ADP) dimulai dengan menambahkan 0,5 mM ADP; keadaan 4 (istirahat) diukur setelah penipisan ADP.
Aplikasi Dunia Nyata
Dalam studi tentang disfungsi mitokondria pada penyakit Parkinson, fibroblas dari pasien dengan mutasi PINK1 menunjukkan penurunan OCR basal (40 pmol/menit vs. 80 pmol/menit pada kontrol) dan kapasitas pernapasan cadangan yang minimal. Suntikan rotenone menegaskan bahwa aktivitas Kompleks I secara khusus terganggu. Temuan ini mendukung hipotesis bahwa disfungsi mitokondria berkontribusi terhadap degenerasi neuron dopaminergik pada penyakit Parkinson.
