Ikhtisar
Analisis pengayaan jalur menentukan apakah set gen yang telah ditentukan, mewakili jalur biologis, kategori fungsional, atau proses seluler, secara statistik terlalu terwakili dalam daftar gen yang berasal dari eksperimental. Pendekatan ini mengubah daftar panjang gen yang diekspresikan secara diferensial menjadi tema biologis yang dapat diinterpretasikan, membantu peneliti beralih dari “gen mana yang berubah?” menjadi “proses mana yang terpengaruh?”. Prinsip intinya adalah jika suatu jalur relevan dengan kondisi yang dipelajari, lebih banyak gen anggotanya akan muncul dalam daftar gen pengguna daripada yang diharapkan secara kebetulan.
Metode
Metode yang paling banyak digunakan mencakup uji tepat Fisher (atau uji hipergeometrik), yang mengevaluasi tumpang tindih antara daftar gen dan set gen jalur terhadap latar belakang yang ditentukan. Analisis Pengayaan Set Gen (GSEA) menghindari ambang signifikansi arbitrer dengan memberi peringkat semua gen berdasarkan metrik ekspresi diferensial dan menguji apakah anggota jalur mengelompok di bagian atas atau bawah dari daftar yang diperingkat. Koreksi pengujian berganda, biasanya tingkat penemuan palsu Benjamini-Hochberg, sangat penting karena ratusan jalur dievaluasi secara bersamaan. Basis data jalur terkurasi seperti KEGG, Reactome, dan Gene Ontology menyediakan set gen referensi.
Aplikasi
Pengayaan jalur adalah langkah rutin dalam studi transkriptomik, proteomik, dan metabolomik. Ini menghubungkan hasil ekspresi diferensial dari eksperimen mikroarray DNA dan ekspresi gen ke biologi fungsional. Peneliti kanker menggunakannya untuk mengidentifikasi jalur yang tidak teratur seperti glikolisis atau siklus asam sitrat, dan ini mengungkap bagaimana regulasi gen dan epigenetik merangkai ulang program seluler dalam penyakit. Analisis pengayaan juga memandu penemuan biomarker dengan menyoroti jalur umum pada jalur metabolik yang terganggu dalam sampel pasien.
Protokol Praktis
Untuk analisis terlalu-terwakili (ORA) menggunakan clusterProfiler di R, mulailah dengan daftar gen yang diekspresikan secara diferensial (mis., padj < 0,05, |log2FC| > 1). Muat paket dan lakukan pengayaan GO: library(clusterProfiler); ego <- enrichGO(gene = de_genes, OrgDb = org.Hs.eg.db, keyType = "SYMBOL", ont = "BP", pAdjustMethod = "BH", pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.2). Parameter ont dapat berupa “BP” (Proses Biologis), “MF” (Fungsi Molekuler), atau “CC” (Komponen Seluler). Untuk pengayaan jalur KEGG, konversi simbol gen menjadi ID Entrez: ekegg <- enrichKEGG(gene = entrez_ids, organism = "hsa", pvalueCutoff = 0.05). Visualisasikan hasil dengan dotplot(ego, showCategory = 20), yang menampilkan rasio gen, nilai p yang disesuaikan, dan jumlah gen per kategori. Fungsi barplot memberikan tampilan alternatif. Untuk analisis pengayaan set gen (GSEA), siapkan daftar gen yang diperingkat diurutkan berdasarkan log2 perubahan ekspresi: genelist <- sort(results$log2FoldChange, decreasing = TRUE); names(genelist) <- rownames(results). Jalankan GSEA menggunakan gseGO(geneList = genelist, OrgDb = org.Hs.eg.db, keyType = "SYMBOL", ont = "BP", minGSSize = 10, maxGSSize = 500, pvalueCutoff = 0.05). GSEA tidak memerlukan ambang signifikansi, membuatnya sensitif terhadap perubahan yang terkoordinasi namun sederhana di seluruh anggota jalur. Fungsi gseaplot2 memvisualisasikan skor pengayaan berjalan untuk jalur tertentu. Untuk analisis berbasis web, gunakan Enrichr: tempel daftar gen di https://maayanlab.cloud/Enrichr, pilih pustaka (KEGG, GO, WikiPathways), dan unduh tabel skor gabungan. Skor gabungan adalah produk dari nilai p yang ditransformasi log dan z-score, memberi peringkat jalur berdasarkan signifikansi dan arah perubahan. Selalu ekspor hasil sebagai CSV dengan kolom untuk ID jalur, deskripsi, rasio gen, nilai p, nilai p yang disesuaikan, dan daftar gen yang tumpang tindih.
