Tampilan fag (phage display) adalah teknik biologi molekuler yang kuat yang menggabungkan secara genetik peptida atau protein asing dengan protein selubung bakteriofag, menampilkannya di permukaan fag sementara DNA pengkode tetap terbungkus di dalamnya. Hubungan langsung genotipe-fenotipe ini memungkinkan penyaringan pustaka besar (>10^9 varian) untuk pengikatan ke target yang diinginkan, dengan fag yang terikat diamplifikasi melalui infeksi bakteri untuk putaran seleksi berikutnya.

Teknik ini banyak digunakan untuk penemuan antibodi, rekayasa protein, pemetaan epitop, dan pengembangan obat, dan diakui dengan Penghargaan Nobel Kimia 2018 yang diberikan kepada George P. Smith dan Sir Gregory P. Winter atas pengembangan dan penerapannya.

Prinsip

Fag filamentosa seperti M13 adalah platform yang paling umum. Genom fag dimodifikasi dengan menggabungkan sekuens DNA asing yang mengkode peptida atau domain protein ke salah satu gen protein selubung, paling sering gen III (pIII, 3–5 salinan di ujung) atau gen VIII (pVIII, ~2700 salinan di sepanjang filamen). Ketika genom fag rekombinan dimasukkan ke dalam E. coli, protein fusi diekspresikan dan diintegrasikan ke dalam virion yang dirakit, menampilkan peptida asing di permukaan. DNA yang mengkode protein yang ditampilkan tetap terikat secara fisik di dalam partikel fag yang sama, menciptakan hubungan langsung antara fenotipe (protein yang ditampilkan) dan genotipe (DNA yang terbungkus). Hubungan ini adalah fitur kunci — memungkinkan peneliti untuk memulihkan materi genetik yang mengkode pengikat yang terseleksi hanya dengan menginfeksi bakteri dengan fag yang terelusi.

Komponen Kunci

Vektor tampilan tersedia dalam dua format. Vektor fag membawa genom fag lengkap dengan fusi yang disisipkan secara langsung, menghasilkan fag rekombinan yang menampilkan fusi pada setiap salinan protein selubung. Vektor fagemid adalah plasmid yang mengandung gen fusi ditambah sinyal pengemasan fag, memerlukan ko-infeksi fag pembantu untuk menyediakan protein struktural yang tersisa dan mesin replikasi — ini menghasilkan campuran protein selubung tipe liar dan fusi, dan merupakan sistem yang lebih umum untuk pustaka antibodi.

Fusi protein selubung menentukan valensi dan aplikasi tampilan. Fusi pIII menampilkan 1–5 salinan per virion dan lebih disukai untuk seleksi berbasis afinitas (valensi rendah meminimalkan efek aviditas). Fusi pVIII menampilkan ratusan salinan, cocok untuk presentasi imunogenik atau ketika aviditas tinggi diinginkan. Sistem alternatif menggunakan pVI, pVII, atau pIX untuk aplikasi khusus.

Fag pembantu (mis., M13KO7, Hyperphage) menyediakan protein selubung tipe liar dan fungsi replikasi yang diperlukan untuk pengemasan fagemid. Mereka membawa asal replikasi yang rusak dan marker seleksi antibiotik.

Siklus Biopanning

Seleksi dilakukan melalui putaran biopanning berulang:

1. Pengikatan — Pustaka fag diinkubasi dengan target yang diimobilisasi (protein dilapisi pada pelat ELISA, target yang dibiotinilasi pada manik streptavidin, sel utuh, atau bagian jaringan). Pengikatan non-spesifik dikurangi dengan pra-pemblokiran menggunakan BSA atau susu dan penambahan deterjen seperti Tween-20.
2. Pencucian — Fag yang tidak terikat dan terikat lemah dihilangkan melalui pencucian berulang dengan kondisi yang semakin ketat (peningkatan garam, deterjen, atau waktu inkubasi).
3. Elusi — Fag yang terikat dipulihkan dari target, biasanya dengan elusi pH rendah (0,1 M glisin-HCl, pH 2,2), pemotongan enzimatik (tripsin untuk fusi yang sensitif terhadap protease), atau elusi kompetitif dengan kelebihan target bebas.
4. Amplifikasi — Kumpulan fag yang terelusi digunakan untuk menginfeksi E. coli (biasanya TG1 atau ER2738), menghasilkan keturunan fag yang diamplifikasi untuk putaran berikutnya. Amplifikasi dilakukan dalam kultur cair dengan penyelamatan fag pembantu.
5. Pengayaan — Setelah 3–5 putaran, kumpulan menjadi diperkaya dalam pengikat afinitas tinggi. Pengayaan dipantau dengan membandingkan titer keluaran antara sumur yang dilapisi target dan sumur kontrol, atau dengan ELISA fag poliklonal.

Pustaka Tampilan Fag

Pustaka peptida menampilkan sekuens peptida acak (biasanya 7–15 asam amino) yang difusikan ke pIII atau pVIII. Ini digunakan untuk pemetaan epitop, penemuan mimotop, dan mengidentifikasi ligan untuk reseptor atau enzim.

Pustaka antibodi menampilkan fragmen variabel rantai tunggal (scFv) atau fragmen pengikat antigen (Fab) pada permukaan fag. Pustaka naif dibangun dari repertoar gen V yang telah diatur ulang dari donor yang diimunisasi atau tidak diimunisasi. Pustaka sintetis dibangun dari kerangka gen V yang direkayasa dengan daerah penentu komplementaritas (CDR) yang diacak. Pustaka imun berasal dari sel B hewan yang diimunisasi dan diperkaya dalam klon spesifik antigen. Tampilan fag adalah salah satu metode utama untuk menghasilkan antibodi manusiawi sepenuhnya untuk penggunaan terapeutik, bersama dengan tikus transgenik dan kloning sel B tunggal.

Pustaka rekayasa protein menampilkan varian termutasi dari protein yang diminati, memungkinkan evolusi terarah untuk meningkatkan afinitas pengikatan, termostabilitas, aktivitas enzimatik, atau hasil ekspresi.

Aplikasi

Penemuan antibodi adalah aplikasi yang paling signifikan secara komersial, dengan puluhan antibodi manusiawi sepenuhnya yang ditemukan melalui tampilan fag mencapai klinik (mis., adalimumab, belimumab, raxibacumab). Tampilan fag memungkinkan generasi antibodi terhadap target yang beracun, tidak imunogenik, atau sangat terkonservasi antar spesies.

Pemetaan epitop menggunakan pustaka peptida tampilan fag untuk mengidentifikasi epitop linier dan konformasional yang dikenali oleh antibodi monoklonal atau serum pasien. Biopanning terhadap antibodi target memilih peptida yang meniru epitop alami, yang diidentifikasi melalui sekuensing DNA dari klon yang diperkaya.

Evolusi protein melalui mutagenesis dan seleksi tampilan fag dapat meningkatkan afinitas pengikatan (maturasi afinitas), mengubah spesifisitas, meningkatkan stabilitas, atau mengembangkan aktivitas enzimatik baru. PCR rawan kesalahan, pengocokan DNA, dan mutagenesis tertarget menghasilkan pustaka varian untuk seleksi.

Terapeutik dan diagnostik tertarget termasuk peptida yang ditampilkan pada fag untuk pengiriman obat tertarget, probe pencitraan, dan molekul pengikat bispesifik. Tampilan fag juga telah digunakan untuk memilih peptida yang menuju ke jaringan tertentu atau vaskulatur tumor in vivo.

Keuntungan dan Keterbatasan

Keuntungan termasuk hubungan langsung genotipe-fenotipe (menyederhanakan identifikasi klon), kemampuan untuk menyaring pustaka yang sangat besar (10^9–10^11 varian), sifat seleksi in vitro (melewati imunisasi), dan sistem produksi bakteri yang kuat dan berbiaya rendah.

Keterbatasan termasuk ukuran protein yang ditampilkan terbatas (protein multi-domain besar mungkin tidak terlipat atau ditampilkan secara efisien), konteks ekspresi prokariotik (kurangnya modifikasi pasca-translasi eukariotik seperti glikosilasi), dan potensi bias dalam representasi pustaka karena efisiensi tampilan yang berbeda atau toksisitas bakteri.

Varian

Teknologi tampilan alternatif mengatasi beberapa keterbatasan ini. Tampilan ribosom dan tampilan mRNA beroperasi sepenuhnya in vitro tanpa sel hidup, memungkinkan pustaka yang lebih besar (10^12–10^14) dan tampilan protein beracun atau tidak stabil. Tampilan ragi menyediakan sistem ekspresi eukariotik dengan mekanisme kontrol kualitas dan memungkinkan diskriminasi kuantitatif melalui pemilahan sel yang diaktifkan fluoresensi (FACS). Setiap platform memiliki kekuatan yang saling melengkapi, dan tampilan fag tetap yang paling banyak digunakan karena ketangguhan, kesederhanaan, dan rekam jejaknya dalam penemuan obat.