Protein A dan Protein G adalah protein pengikat imunoglobulin bakteri yang mengikat daerah Fc antibodi, memungkinkan pemurnian cepat satu langkah antibodi poliklonal dan monoklonal dari serum, cairan asites, atau supernatan kultur sel.
Prinsip
Protein A (dari Staphylococcus aureus) dan Protein G (dari Streptococcus sp.) mengikat secara spesifik daerah Fc antibodi IgG tanpa mengenali daerah pengikat antigen Fab. Ini mempertahankan fungsionalitas antibodi setelah pemurnian. Protein bakteri diimobilisasi pada agarosa atau manik magnetik dan digunakan sebagai reagen penangkapan afinitas. Antibodi mengikat pada pH fisiologis dan dielusi pada pH rendah (2,5–3,0), yang mengganggu interaksi Fc-Protein A/G. Fraksi yang terelusi segera dinetralkan untuk mencegah denaturasi yang dikatalisis asam.
Protein A vs. Protein G
Protein A mengikat subkelas IgG manusia dengan afinitas bervariasi: kuat terhadap IgG1, IgG2, dan IgG4 tetapi lemah terhadap IgG3. Ini juga mengikat IgG kelinci, babi, anjing, dan marmut dengan baik tetapi kurang mengikat IgG kambing, domba, tikus, dan mencit IgG1. Protein G mengikat rentang subkelas IgG yang lebih luas antar spesies, termasuk semua subkelas IgG manusia, mencit IgG1, kambing, domba, dan tikus IgG. Protein A/G adalah protein fusi rekombinan yang menggabungkan domain pengikatan keduanya, memberikan cakupan spesies dan subkelas terluas. Pilihan tergantung pada spesies antibodi dan isotipe. Untuk sebagian besar sera poliklonal, agarosa Protein A/G menawarkan hasil terbaik.
Format Resin
Protein A, Protein G, dan Protein A/G tersedia terikat pada agarosa, Sepharose, dan manik magnetik. Protein A Sepharose (Cytiva) dan MabSelect SuRe (turunan Protein A yang distabilkan alkali) adalah standar untuk pemurnian antibodi monoklonal. Varian Protein A rekombinan dengan stabilitas alkali yang ditingkatkan memungkinkan pembersihan dengan 0,1–0,5 M NaOH untuk penghilangan endotoksin. Kapasitas pengikatan berkisar dari 5–20 mg IgG manusia per mL resin, tergantung pada resin dan kondisi aliran. Resin kapasitas tinggi (30–50 mg/mL) digunakan untuk bioprocessing.
Sistem Buffer
Buffer pemuatan: 20 mM natrium fosfat, 150 mM NaCl, pH 7,4 (PBS) atau 20 mM Tris-HCl, pH 7,5–8,0. Buffer pencuci: sama dengan pemuatan, kadang dengan 0,1% Tween-20 atau 1 M NaCl untuk pencucian ketat. Buffer elusi: 0,1 M glisin-HCl, pH 2,5–3,0, atau 0,1 M sitrat, pH 3,0. Buffer netralisasi: 1 M Tris-HCl, pH 8,5–9,0 (tambahkan 50–100 µL per mL eluat). Untuk elusi ringan, 2–3 M MgCl₂ atau 3,5 M KSCN dapat digunakan, meskipun kaotrop ini dapat memengaruhi beberapa antibodi.
Protokol
Equilibrasi resin Protein A/G dengan buffer pemuatan. Muat serum yang telah diklarifikasi (diencerkan 1:1 dalam buffer pemuatan) atau supernatan kultur (dipekatkan 10 kali lipat jika titer rendah) pada 0,5–1 mL/menit atau rotasi curah selama 30 menit pada 4 °C. Cuci dengan 10–15 volume kolom buffer pemuatan hingga A₂₈₀ mencapai baseline. Elusi dengan 5–10 volume kolom buffer elusi, kumpulkan fraksi 0,5–1 mL ke dalam tabung yang berisi buffer netralisasi. Gabungkan fraksi puncak A₂₈₀ dan dialisis atau pertukaran buffer ke dalam PBS atau buffer penyimpanan. SDS-PAGE dalam kondisi reduksi menunjukkan pita 25 kDa (rantai ringan) dan 50 kDa (rantai berat).
Maturasi Afinitas dan Varian Rekayasa
Varian Protein A rekombinan (MabSelect SuRe, ProSep Ultra Plus) direkayasa untuk kapasitas pengikatan lebih tinggi, stabilitas alkali yang ditingkatkan (toleransi >0,5 M NaOH untuk pembersihan di tempat), dan pengurangan pelindian ligan. Resin ini penting untuk manufaktur biofarmasi di mana penggunaan ulang kolom (>100 siklus) dan persyaratan kemurnian ketat berlaku.
Aplikasi
Pemurnian Protein A/G adalah standar emas untuk pemurnian antibodi dalam penelitian dan industri. Antibodi monoklonal dari supernatan hibridoma, antibodi poliklonal dari serum kelinci atau kambing, dan antibodi monoklonal terapeutik manusia dari kultur sel CHO secara rutin dimurnikan dengan metode ini. Imunopresipitasi kompleks antibodi-antigen menggunakan manik magnetik Protein A/G untuk menangkap antibodi, bersama dengan antigen terikatnya. Untuk format throughput tinggi, Protein A/G digunakan dalam penangkapan afinitas multipleks dan skrining antibodi plat 96-sumur.
