Uji gen reporter adalah landasan biologi molekuler untuk mempelajari regulasi gen. Gen reporter mengkode protein yang aktivitasnya mudah diukur, dan ditempatkan di bawah kendali promotor atau elemen regulatorik yang diminati.
Reporter Umum
- Firefly luciferase (dari Photinus pyralis): mengkatalisis oksidasi D-luciferin, menghasilkan cahaya pada 560 nm. Sinyal diukur dengan luminometer. Memiliki rentang dinamis yang sangat tinggi (7–8 orde magnitudo) dan hampir tanpa latar belakang pada sel mamalia.
- Renilla luciferase (dari Renilla reniformis): menggunakan koelenterazin sebagai substrat, memancar pada 480 nm. Umumnya digunakan sebagai reporter kontrol untuk normalisasi dalam uji dual-luciferase.
- Green fluorescent protein (GFP): dari Aequorea victoria, berpendar pada 509 nm ketika dieksitasi pada 395 nm. Varian mencakup seluruh spektrum tampak (CFP, YFP, RFP, mCherry). Fluoresensi dapat diukur dengan fluorometer, flow cytometer, atau mikroskop, memungkinkan analisis sel hidup dan sel tunggal.
- β-Galactosidase (LacZ): membelah X-gal untuk menghasilkan endapan biru (kolorimetri) atau ONPG untuk menghasilkan produk kuning (absorbansi pada 420 nm). Sederhana dan murah tetapi kurang sensitif dibandingkan luciferase.
- SEAP (secreted alkaline phosphatase): disekresikan ke dalam medium kultur, memungkinkan pengambilan sampel berulang dari kultur yang sama tanpa melisiskan sel. Diukur dengan substrat kemiluminesen.
- CAT (chloramphenicol acetyltransferase): reporter klasik, dideteksi dengan ELISA atau uji radioaktif. Sekarang sebagian besar digantikan oleh luciferase dan GFP.
Uji Dual-Luciferase
Uji dual-luciferase menggunakan firefly dan Renilla luciferase dalam sampel yang sama. Promotor uji mendorong firefly luciferase, dan promotor konstitutif (misalnya, SV40, TK) mendorong Renilla luciferase sebagai kontrol internal. Setelah mengukur luminesensi firefly, reagen memadamkannya dan mengaktifkan luminesensi Renilla. Rasio firefly/Renilla menormalkan efisiensi transfeksi dan jumlah sel.
Aplikasi
Uji reporter digunakan untuk:
- Memetakan daerah promotor dan enhancer
- Mempelajari aktivitas faktor transkripsi
- Mengukur aktivasi jalur pensinyalan (misalnya, NF-κB, CREB, STAT)
- Menyaring senyawa yang memodulasi ekspresi gen
- Memantau aktivitas miRNA (reporter 3′ UTR)
- Mengkuantifikasi efisiensi transfeksi
