Kromatografi fase terbalik memisahkan molekul berdasarkan hidrofobisitas, menggunakan fase diam nonpolar dan fase gerak polar. Ini adalah mode kromatografi cair yang paling banyak digunakan dalam kimia analitik dan proteomik.
Prinsip
Fase diam terdiri dari rantai alkil (C₄, C₈, C₁₈, atau gugus fenil) yang terikat secara kovalen pada partikel silika atau polimer. Fase gerak adalah campuran air dan pelarut organik yang dapat bercampur dengan air seperti asetonitril, metanol, atau isopropanol. Senyawa polar berinteraksi lemah dengan fase diam nonpolar dan terelusi awal, sementara senyawa nonpolar berpartisi ke dalam fase diam dan terelusi kemudian ketika konsentrasi pelarut organik meningkat. Retensi diatur oleh hidrofobisitas analit, dijelaskan oleh log P, koefisien partisi oktanol-air.
Fase Diam
Kolom C₁₈ (oktadesil) adalah yang paling umum, memberikan retensi kuat untuk rentang analit yang luas. Kolom C₈ (oktil) menawarkan retensi sedikit lebih rendah dan selektivitas berbeda. Kolom C₄ lebih disukai untuk protein karena rantai alkil yang lebih pendek mengurangi denaturasi. Kolom fenil menambahkan interaksi pi-pi aromatik. Partikel core-shell (fused-core) menggabungkan inti padat dengan cangkang berpori, mengurangi jalur difusi dan meningkatkan efisiensi tanpa tekanan ultra-tinggi. Partikel berpori penuh sub-2 µm memungkinkan pemisahan UHPLC.
Fase Gerak
Fase air biasanya air dengan 0,1% asam format (untuk MS), 0,05% TFA (untuk peptida), atau buffer fosfat (untuk deteksi UV). Fase organik adalah asetonitril (batas UV rendah, viskositas rendah), metanol (viskositas lebih tinggi, selektivitas berbeda), atau isopropanol (eluen kuat, berguna untuk senyawa sangat hidrofobik). Elusi gradien meningkatkan proporsi organik dari 5% menjadi 95% selama 10–60 menit. Elusi isokratik menggunakan komposisi konstan untuk pemisahan sederhana.
Retensi dan Selektivitas
Faktor retensi k’ menggambarkan seberapa kuat suatu analit dipertahankan. Selektivitas α menggambarkan pemisahan antara dua puncak. Resolusi Rₛ menggabungkan retensi, selektivitas, dan efisiensi. Panjang kolom, ukuran partikel, laju alir, suhu, dan kemiringan gradien semuanya memengaruhi resolusi. Analisis Van Deemter dari tinggi pelat versus kecepatan linier membantu mengoptimalkan efisiensi untuk kolom tertentu.
Pemetaan Peptida Tripsin
RPC adalah metode pilihan untuk pemetaan peptida dalam proteomik. Protein dicerna dengan tripsin, yang memotong setelah residu lisin dan arginin. Peptida yang dihasilkan dipisahkan pada kolom C₁₈ dengan gradien asetonitril. Setiap protein menghasilkan peta peptida yang khas. Dalam proteomik bottom-up, kolom RPC digabungkan langsung ke spektrometer massa ionisasi elektrospray. Kolom RPC aliran nano (diameter dalam 75 µm, diisi dengan C₁₈ 3 µm) pada 200–300 nL/menit memberikan sensitivitas yang diperlukan untuk menganalisis sampel protein rendah nanogram. Pemisahan multi-dimensi menggabungkan kation kuat dengan RPC dalam alur kerja MudPIT.
Desalting
RPC juga berfungsi sebagai langkah desalting atau pertukaran buffer. Peptida yang dimuat ke kolom perangkap C₁₈ dalam kondisi air dipertahankan sementara garam dan kontaminan hidrofilik melewatinya. Gradien pendek mengelusi sampel yang telah dibersihkan langsung ke spektrometer massa (konfigurasi perangkap-elusi), meningkatkan stabilitas ionisasi dan sensitivitas.
Aplikasi
RPC diterapkan di seluruh analisis farmasi (kemurnian obat, uji stabilitas), kimia klinis (pemantauan obat terapeutik, profiling steroid), analisis makanan (residu pestisida, aditif), dan analisis lingkungan (kontaminan dalam air). Dalam bioteknologi, RPC menganalisis varian protein rekombinan, produk deamidasi, dan spesies oksidasi yang penting untuk penilaian kualitas produk. Pemetaan peptida oleh RPC adalah uji pelepasan untuk identitas biofarmasi dan konsistensi batch.
