Ikhtisar
Urutan RNA sel tunggal (scRNA-seq) mengukur transkriptom sel individual, memberikan resolusi heterogenitas seluler yang belum pernah terjadi sebelumnya. RNA-seq massal rata-rata ekspresi gen di jutaan sel, menutupi keadaan transkripsional yang berbeda dari jenis sel yang berbeda. Sebaliknya, scRNA-seq menangkap profil ekspresi setiap sel secara terpisah, memungkinkan penemuan populasi sel langka, rekonstruksi lintasan perkembangan, dan karakterisasi respons spesifik tipe sel. Sejak studi scRNA-seq pertama pada tahun 2009, teknologi ini telah berkembang pesat, dengan platform modern yang membuat profil puluhan ribu sel dalam satu percobaan.
Metode
Alur kerja scRNA-seq melibatkan isolasi sel (menggunakan platform berbasis tetesan seperti 10x Genomics Chromium, mikrofluida seperti Fluidigm C1, atau metode berbasis pelat), membalikkan transkripsi dengan pengidentifikasi molekul unik (UMI) untuk menghilangkan bias amplifikasi, dan persiapan perpustakaan untuk pengurutan. Analisis bioinformatika berlangsung melalui: kontrol kualitas (menyaring sel berdasarkan jumlah gen, konten mitokondria, dan jumlah UMI), normalisasi (SCTransform, scran, atau BASiCS), koreksi batch (Harmoni, CCA Seurat, atau scVI), pengurangan dimensi (PCA diikuti dengan visualisasi UMAP atau t-SNE), pengelompokan (algoritma Louvain atau Leiden), dan diferensial ekspresi antar cluster. Anotasi tipe sel menggunakan gen penanda dan database referensi.
Aplikasi
scRNA-seq telah mengubah banyak bidang. Penelitian ini telah menciptakan atlas sel komprehensif untuk organ manusia, memetakan embrio yang sedang berkembang, dan mengungkap subtipe sel yang sebelumnya tidak diketahui di otak dan sistem kekebalan tubuh. Dalam penelitian kanker, scRNA-seq membedah heterogenitas tumor dan lingkungan mikro tumor, mengidentifikasi penanda keadaan sel terkait aliran sitometri yang resistan terhadap obat. Teknik ini dibangun berdasarkan prinsip inti pengurutan RNA dan konsep array mikro DNA dan ekspresi gen. Metode transkriptomik spasial yang sedang berkembang kini menambahkan konteks posisi pada data sel tunggal, mengungkap bagaimana sel berorganisasi di dalam jaringan.
Protokol Praktis
Eksperimen 10x Genomics scRNA-seq dimulai dengan menyiapkan suspensi sel tunggal pada konsentrasi 700–1200 sel/µL dengan viabilitas di atas 90%. Pengontrol Chromium mempartisi sel menjadi Gel Bead-In-Emulsions (GEM) berskala nanoliter, masing-masing berisi manik berkode dengan 10x kode batang dan UMI unik. Setelah transkripsi terbalik dalam GEM, cDNA yang diberi kode batang dikumpulkan dan diperkuat. Konstruksi perpustakaan melibatkan fragmentasi enzimatik, perbaikan akhir, A-tailing, ligasi adaptor, dan indeks sampel PCR. Sequencing dilakukan pada platform Illumina dengan konfigurasi baca R1 28 siklus (10x barcode dan UMI), R2 91 siklus (cDNA insert), dan i7 indeks 8 siklus. Pipeline Cell Ranger memproses file BCL mentah menjadi FASTQ menggunakan cellranger mkfastq, lalu menyelaraskan pembacaan ke genom referensi dengan STAR melalui cellranger count. Outputnya mencakup matriks kode batang fitur yang difilter, penyematan UMAP, dan hasil pengelompokan. Analisis downstream di R menggunakan Seurat: CreateSeuratObject, SCTransform untuk normalisasi, RunPCA dan RunUMAP untuk reduksi dimensi, dan FindClusters dengan algoritma Leiden. Dengan Python, Scanpy menyediakan fungsi analog: sc.pp.filter_cells, sc.pp.normalize_total, sc.pp.log1p, sc.tl.pca, dan sc.tl.leiden. Deteksi doublet dengan DoubletFinder atau scrublet direkomendasikan sebelum pengelompokan, dan integrasi batch di seluruh sampel dapat dilakukan dengan Harmony atau scVI.
