Pemurnian Strep-tag menggunakan tag peptida pendek (Strep-tag II) yang mengikat secara spesifik streptavidin hasil rekayasa (Strep-Tactin) untuk pemurnian protein satu langkah yang ringan dalam kondisi fisiologis tanpa ion logam atau agen pereduksi.
Prinsip
Strep-tag II adalah sekuens peptida delapan asam amino (WSHPQFEK) yang meniru interaksi biotin dengan streptavidin. Ia mengikat Strep-Tactin, varian streptavidin hasil rekayasa dengan kantong pengikatan yang dimodifikasi yang mengakomodasi peptida dengan afinitas tinggi (K_d ≈ 1 µM). Pengikatan bersifat reversibel: elusi menggunakan 2,5 mM desthiobiotin, analog biotin yang secara kompetitif menggantikan tag. Desthiobiotin mengikat lebih lemah daripada biotin dan dihilangkan selama pertukaran buffer, memungkinkan regenerasi resin. Alternatifnya, 10 mM biotin dapat digunakan untuk elusi lengkap tetapi mencegah penggunaan ulang resin. Seluruh prosedur kompatibel dengan buffer fisiologis, mempertahankan struktur dan aktivitas protein asli.
Twin-Strep-Tag
Twin-Strep-tag (dua sekuens Strep-tag II secara tandem dipisahkan oleh penghubung pendek) secara dramatis meningkatkan afinitas pengikatan (K_d ≈ 10⁻¹¹ M), memungkinkan penangkapan protein yang diekspresikan pada tingkat sangat rendah dan pemurnian dari sampel encer. Ini juga memungkinkan penangkapan kuantitatif kompleks protein. Twin-Strep-tag direkomendasikan untuk target yang menantang dan untuk penangkapan afinitas mitra interaksi protein dari tingkat ekspresi endogen.
Resin dan Format
Strep-Tactin agarosa (IBA Lifesciences, sekarang bagian dari Cube Biotech) menawarkan kapasitas pengikatan sekitar 50 nmol peptida Strep-tag II per mL (≈1,3 mg protein 26 kDa). Resin kinerja tinggi Strep-Tactin Superflow kompatibel dengan sistem FPLC pada laju alir hingga 5 mL/menit. Manik magnetik Strep-Tactin tersedia untuk pemurnian skala kecil dan eksperimen penarikan-turun. Strep-TactinXT adalah versi yang ditingkatkan dengan afinitas lebih tinggi untuk Strep-tag II konvensional, menghilangkan kebutuhan akan Twin-Strep tag yang lebih besar di sebagian besar aplikasi.
Buffer
Buffer pemuatan/pencuci: 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. Buffer elusi: buffer pemuatan ditambah 2,5 mM desthiobiotin. Buffer regenerasi: 1 mM HABA (hydroxyazophenyl-benzoic acid) atau 10 mM biotin dalam buffer pemuatan untuk menghilangkan sisa protein terikat atau desthiobiotin. Buffer kompatibel dengan agen pereduksi (< 2 mM DTT atau TCEP) dan deterjen ringan (0,1% Triton X-100, 0,05% NP-40). Agen pereduksi kuat (> 10 mM DTT) dan larutan yang mengandung biotin (> 2 µM) harus dihindari dalam langkah pemuatan karena mengganggu pengikatan.
Protokol
Equilibrasi resin Strep-Tactin dengan buffer pemuatan. Muat lisat yang telah diklarifikasi (inkubasi curah 30 menit, 4 °C, atau kolom pada 0,5–1 mL/menit). Cuci dengan 10–20 volume kolom buffer pemuatan. Elusi dengan 6–10 volume kolom buffer elusi (desthiobiotin). Jika menggunakan biotin, elusi dengan 5 volume kolom dan perhatikan bahwa resin tidak dapat digunakan kembali. Regenerasi dengan buffer HABA atau biotin, kemudian equilibrasi untuk penggunaan ulang hingga lima kali. Kumpulkan fraksi dan analisis dengan SDS-PAGE.
Kelebihan
Strep-tag berukuran kecil (8 asam amino, 1 kDa) dan jarang memengaruhi fungsi protein, membuat penghilangan tag tidak diperlukan untuk sebagian besar aplikasi. Elusi dengan desthiobiotin dalam kondisi fisiologis mempertahankan aktivitas enzimatik, integritas kompleks, dan pengikatan antibodi. Sistem ini kompatibel dengan His-tag untuk pemurnian tag ganda. Tidak adanya ion logam menghilangkan risiko oksidasi yang dikatalisis logam. Aplikasi meliputi pemurnian protein rekombinan, isolasi kompleks protein, dan penarikan-turun mitra interaksi.
