Surface plasmon resonance (SPR) mengukur pengikatan dan disosiasi molekul secara waktu nyata tanpa label fluoresen atau radioaktif. Ini adalah standar emas untuk menentukan afinitas pengikatan (KD), laju asosiasi (ka), dan laju disosiasi (kd).

Prinsip

SPR mendeteksi perubahan indeks refraksi pada permukaan sensor emas. Satu interaktan (ligan) diimobilisasi pada permukaan sensor. Larutan yang mengandung interaktan lain (analit) mengalir di atas permukaan. Saat molekul analit berikatan dengan ligan, massa di permukaan meningkat, mengubah indeks refraksi. Perubahan ini diukur secara kontinu dan diplot sebagai sensorgram (respons dalam unit resonansi vs. waktu).

Sensorgram

Eksperimen SPR tipikal terdiri dari:

1. Baseline: buffer mengalir di atas permukaan.
2. Asosiasi: analit disuntikkan; respons meningkat saat pengikatan terjadi.
3. Ekuilibrium: laju pengikatan sama dengan laju disosiasi; respons mencapai dataran tinggi.
4. Disosiasi: buffer menggantikan analit; respons menurun saat kompleks terdisosiasi.

Beberapa konsentrasi analit disuntikkan di atas permukaan ligan yang sama untuk menghasilkan serangkaian sensorgram. Pencocokan global data ke model pengikatan 1:1 menghasilkan ka, kd, dan KD yang dihitung (= kd/ka).

Instrumentasi

Biacore (Cytiva) adalah platform SPR yang paling banyak digunakan. Chip sensor memiliki permukaan emas yang dilapisi dengan matriks dekstran karboksimetilasi yang menyediakan lingkungan hidrofilik untuk imobilisasi. Platform lain termasuk Sierra Sensors, Reichert, dan Nicoya.

Metode Imobilisasi

• Amine coupling: metode paling umum. Gugus karboksil pada permukaan dekstran diaktivasi dengan EDC/NHS untuk membentuk ester reaktif yang bereaksi dengan amina primer pada ligan. Sederhana tetapi orientasi acak.
• Capture coupling: molekul penangkap (anti-His antibody, streptavidin, Protein A) diamine-coupled, dan ligan ditangkap dari persiapan kasar atau murni. Ini memastikan orientasi seragam dan memungkinkan regenerasi permukaan tanpa merusak ligan.
• Biotin–streptavidin: ligan yang dibiotinilasi ditangkap pada permukaan berlapis streptavidin. Stabilitas hampir kovalen dengan imobilisasi terorientasi.

Aplikasi

• Peringkat afinitas: menyaring klon antibodi untuk afinitas tertinggi.
• Epitope binning: menentukan apakah dua antibodi berikatan pada epitop yang tumpang tindih.
• Analisis konsentrasi: mengukur konsentrasi aktif menggunakan pendekatan bebas kalibrasi.
• Analisis molekul kecil: instrumen SPR modern mendeteksi molekul sekecil 100 Da.
• Karakterisasi kinetik: penentuan ka, kd, dan KD lengkap untuk kandidat obat.

Keterbatasan

SPR memerlukan ligan yang relatif murni dan pengetahuan tentang stoikiometri pengikatan. Keterbatasan transport massa (analit berikatan lebih cepat daripada dapat berdifusi ke permukaan) dapat mendistorsi kinetika dan diatasi dengan menggunakan laju aliran tinggi dan densitas ligan rendah. Pengikatan non-spesifik ke permukaan atau matriks harus diminimalkan dengan mengoptimalkan buffer running (menambahkan surfaktan, BSA, atau gliserol).