Sebelum CRISPR/Cas9 menjadi platform dominan untuk pengeditan genom, TALENs dan ZFN adalah alat utama untuk modifikasi genom tertarget. Keduanya menggunakan domain pengikat DNA modular yang digabungkan dengan domain endonuklease FokI.
Nuklease Jari Seng
ZFN terdiri dari 3–6 modul jari seng, masing-masing mengenali 3–4 bp DNA. Dua monomer ZFN mengikat situs yang berdekatan dengan spacer 5–7 bp di antaranya. FokI harus dimerisasi untuk memotong DNA, sehingga hanya kompleks ZFN-FokI berpasangan yang membuat pemutusan untai ganda.
Modul jari seng tidak benar-benar modular: spesifisitas setiap jari dipengaruhi oleh tetangganya, membuat desain ZFN sulit. Sebagian besar ZFN harus dipilih dari pustaka kombinatorial besar atau direkayasa menggunakan platform proprietary (Sangamo Biosciences). Kompleksitas ini membatasi adopsi ZFN meskipun keberhasilan mereka dalam uji terapi awal (SB-728-T untuk HIV, fase 1).
TALENs
TALENs menggunakan domain pengikat DNA dari efektor TAL bakteri Xanthomonas. Setiap ulangan TAL mengenali satu nukleotida melalui dua residu asam amino hipervariabel (repeat-variable diresidue, RVD). Kodenya sederhana dan dapat diprediksi:
- HD → C
- NG → T
- NI → A
- NN → G atau A
- NH → G (spesifisitas lebih tinggi)
Array TALEN tipikal memiliki 12–20 ulangan yang menargetkan sekuens 12–20 bp. Seperti ZFN, TALENs digunakan sebagai pasangan yang mengapit spacer 12–20 bp, dengan domain FokI berdimerisasi melintasi spacer.
Perakitan TALEN bersifat modular, setiap ulangan adalah bagian terstandarisasi, dan metode seperti kloning Golden Gate (MoClo, Golden TALEN, FLASH) memungkinkan perakitan array TALEN dari modul ulangan yang sudah jadi.
Perbandingan dengan CRISPR/Cas9
| Fitur | ZFN | TALEN | CRISPR/Cas9 |
|---|---|---|---|
| Desain | Sulit | Sedang | Mudah |
| Panjang target | 18–36 bp | 24–40 bp | 20 bp + PAM |
| Efek off-target | Rendah | Sangat rendah | Variabel |
| Multiplexing | Sulit | Sulit | Mudah |
| Biaya | Tinggi | Sedang | Rendah |
| Ukuran pengiriman | Kecil (1 kb) | Besar (3 kb) | Sedang (4 kb untuk Cas9) |
TALENs menawarkan tingkat off-target terendah dari ketiga platform karena situs target lebih panjang dan setiap ulangan TAL mengikat satu nukleotida. Namun, ukuran besar setiap monomer TALEN (~3 kb) membuat pengiriman dalam vektor AAV menjadi tantangan. ZFN cukup kecil untuk pengemasan AAV tetapi sulit direkayasa secara internal.
Aplikasi
ZFN dan TALENs masih digunakan dalam aplikasi di mana pemotongan off-target harus diminimalkan secara absolut (misalnya, pengeditan terapi dalam sel punca) atau di mana persyaratan PAM CRISPR bersifat restriktif. TALENs tidak memiliki persyaratan PAM dan dapat menargetkan sekuens apa pun, termasuk sekuens yang tidak memiliki PAM NGG.
