Di luar pengeditan CRISPR/Cas9 dasar, rekayasa genome mencakup skrining fungsional pooled dan nuklease alternatif untuk modifikasi urutan yang presisi.
Skrining CRISPR
Skrining CRISPR adalah metode genomik fungsional throughput tinggi yang menggunakan perpustakaan lentiviral pooled dari single-guide RNAs (sgRNAs) untuk menghilangkan setiap gen dalam genom dan mengidentifikasi gen yang terlibat dalam fenotipe yang diminati.
Skrining tipikal:
- Perpustakaan sgRNA lentiviral (misalnya, perpustakaan Brunello: 4 sgRNA per gen, total 77.000 sgRNA) ditransduksi ke dalam sel yang mengekspresikan Cas9 pada multiplisitas infeksi rendah (~0,3) untuk memastikan sebagian besar sel menerima satu sgRNA.
- Sel dikenai tekanan seleksi: perawatan obat, paparan toksin, atau fenotipe berbasis sortir (misalnya, reporter untuk jalur pensinyalan).
- DNA genom diekstraksi, dan urutan sgRNA diperkuat oleh PCR dan dikuantifikasi dengan sekuensing generasi berikutnya.
- sgRNA yang habis atau diperkaya dalam kelompok yang dirawat dibandingkan dengan kontrol mengidentifikasi gen yang penting untuk kelangsungan hidup atau resistensi.
Skrining CRISPR lebih sensitif dan spesifik daripada skrining shRNA karena Cas9 menciptakan knockout lengkap dan memiliki lebih sedikit efek di luar target.
TALENs
Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) adalah enzim restriksi buatan yang dibuat dengan menggabungkan domain pengikat DNA TAL effector ke domain nuklease FokI. Setiap pengulangan TAL effector mengenali satu pasang basa DNA, memungkinkan perakitan modular domain pengikat yang menargetkan urutan apa pun.
Domain FokI harus dimerisasi, sehingga TALENs digunakan berpasangan yang mengapit situs target. Dimerisasi menciptakan pemutusan untai ganda (DSB) pada target, yang diperbaiki oleh non-homologous end joining (NHEJ) — menghasilkan sisipan atau delesi kecil — atau oleh homology-directed repair (HDR) jika templat perbaikan disediakan.
TALENs lebih spesifik daripada sistem CRISPR awal tetapi lebih sulit untuk dibangun karena setiap target baru memerlukan perakitan array pengulangan baru.
Zinc Finger Nucleases (ZFNs)
ZFNs menggabungkan domain zinc finger (masing-masing mengenali ~3 bp) ke domain nuklease FokI. Seperti TALENs, mereka memerlukan situs pengikatan berpasangan dan dimerisasi FokI untuk aktivitas. ZFNs adalah nuklease tertarget pertama yang digunakan secara luas tetapi sebagian besar telah digantikan oleh CRISPR dan TALENs karena kesulitan merekayasa array zinc finger dengan spesifisitas tinggi.
Memilih Pendekatan
- CRISPR adalah yang paling sederhana dan paling skalabel — cocok untuk skrining seluruh genom dan pengeditan rutin.
- TALENs menawarkan pengeditan di luar target yang lebih rendah dan lebih disukai ketika pengenalan basa tunggal yang presisi diperlukan atau ketika mengedit dalam organisme di mana kendala PAM CRISPR membatasi.
- ZFNs tetap berguna dalam konteks tertentu seperti terapi gen (di mana ukuran yang lebih kecil membantu pengemasan virus) dan pada organisme di mana alat lain kurang berkembang.
