Ikhtisar
Perakitan transkriptome adalah rekonstruksi komputasi dari urutan transkrip yang diekspresikan dari pembacaan RNA-seq, yang dilakukan dengan atau tanpa genom referensi. Untuk organisme yang tidak mempunyai urutan genom, perakitan transkriptom de novo adalah satu-satunya pilihan, yang memberikan pandangan pertama tentang potensi pengkodean suatu organisme. Bahkan ketika genom referensi tersedia, perakitan transkriptom dapat menangkap isoform baru, transkrip fusi, dan rangkaian dari wilayah genom yang tidak tersusun dengan baik. Transkriptome yang dikumpulkan berfungsi sebagai dasar untuk analisis hilir termasuk kuantifikasi ekspresi, anotasi fungsional, dan studi perbandingan.
Metode
Perakitan transkriptom De novo menggunakan algoritma perakitan yang dirancang untuk cakupan yang tidak merata dan penyambungan alternatif. Alat populer termasuk Trinity, yang menggunakan pendekatan grafik de Bruijn dengan beberapa ukuran k-mer; rnaSPAdes, diadaptasi dari perakitan genom; dan SOAPdenovo-Trans. Alat-alat ini merakit bacaan ke dalam contig yang mewakili fragmen transkrip, kemudian mengelompokkan contig terkait ke dalam kelompok isoform dan menyelesaikan transkrip lengkap. Perakit yang dipandu referensi (StringTie, Cufflinks) memanfaatkan penyelarasan splice-aware ke genom dan merakit pembacaan yang tumpang tindih ke dalam model transkrip. Metrik kualitas utama mencakup kelengkapan perakitan (skor BUSCO terhadap ortolog yang dilestarikan), panjang N50, dan jumlah transkrip lengkap yang dipulihkan. Pengurangan redundansi menggunakan transkrip CD-HIT atau cluster Corset yang sangat mirip.
Aplikasi
Perakitan transkriptome memungkinkan penemuan gen pada organisme non-model, mulai dari tanaman pertanian hingga spesies laut yang belum dieksplorasi. Ini mengidentifikasi gen yang diekspresikan secara berbeda, isoform spesifik jaringan, dan transkrip fusi pada kanker. Teknik ini penting ketika data pengurutan RNA berasal dari organisme tanpa referensi, dan terintegrasi secara mendalam dengan alur kerja pengurutan generasi berikutnya. Transkriptom yang dikumpulkan juga berkontribusi pada studi evolusi dengan memungkinkan perbandingan lintas spesies struktur dan tipe RNA. Seiring dengan peningkatan pengurutan pembacaan panjang (Iso-Seq, Oxford Nanopore), strategi perakitan hibrid yang menggabungkan pembacaan pendek dan panjang menghasilkan transkriptom yang lebih lengkap dan akurat daripada sebelumnya.
Protokol Praktis
Untuk perakitan transkriptom de novo dengan Trinity, pertama-tama pastikan pembacaan RNA-seq telah mengalami pemangkasan kualitas dengan Trimmomatic. Jalankan Trinity dengan perintah: Trinity --seqType fq --max_memory 50G --CPU 8 --left reads_R1.fastq --right reads_R2.fastq --output trinity_out_dir. Trinity beroperasi dalam tiga modul: Inchworm merakit grafik k-mer menjadi contigs, cluster Chrysalis contigs menjadi grafik de Bruijn yang mewakili varian transkrip lengkap, dan Butterfly menelusuri jalur melalui grafik ini untuk merekonstruksi urutan isoform. Outputnya adalah Trinity.fasta yang berisi transkrip rakitan. Menilai kualitas perakitan dengan BUSCO terhadap kumpulan data silsilah yang sesuai: busco -i Trinity.fasta -l eukariota_odb10 -o busco_out -m transkriptome. Skor BUSCO lengkap di atas 80% menunjukkan perakitan berkualitas tinggi. Metrik tambahan mencakup contig N50 (dihitung dengan TrinityStats.pl Trinity.fasta) dan jumlah transkrip rakitan yang cocok dengan protein yang diketahui melalui BLASTX terhadap UniProt. Kurangi redundansi dengan CD-HIT-EST -c 0.95 -i Trinity.fasta -o Trinity_nr.fasta untuk mengelompokkan isoform dengan identitas 95%. Untuk perakitan yang dipandu referensi dengan StringTie, penyelarasan pertama dibaca dengan STAR: stringtie -p 8 -G annotation.gtf -o assembly.gtf aligned.bam. StringTie merakit transkrip menggunakan algoritma aliran jaringan dan dapat dijalankan tanpa referensi GTF untuk penemuan transkrip baru. Gabungkan rakitan di seluruh sampel dengan stringtie --merge untuk membuat transkriptom terpadu. Hitung ekspresi dengan stringtie -e -B dan gunakan prepDE.py untuk menghasilkan matriks hitungan untuk analisis ekspresi diferensial.
