Elektroforesis gel poliakrilamida dua dimensi memisahkan campuran protein kompleks berdasarkan titik isoelektrik pada dimensi pertama dan berat molekul pada dimensi kedua, menghasilkan peta resolusi tinggi dari ratusan hingga ribuan bercak protein dalam satu gel.
Prinsip
2D-PAGE menggabungkan dua prinsip pemisahan ortogonal. Pada dimensi pertama, protein dipisahkan melalui fokus isoelektrik berdasarkan muatan bersihnya. Pada dimensi kedua, protein dipisahkan berdasarkan berat molekul melalui SDS-PAGE, identik dengan SDS-PAGE satu dimensi standar. Hasilnya adalah larik dua dimensi bercak, masing-masing sesuai dengan isoform protein spesifik atau keadaan modifikasi.
Dimensi Pertama — Fokus Isoelektrik
Sampel dilarutkan dalam buffer yang mengandung urea, tiourea, deterjen CHAPS, DTT, dan amfolit pembawa. Strip gradien pH terimobilisasi menyediakan gradien pH yang stabil dan reprodusibel mulai dari sempit (pH 4–7) hingga lebar (pH 3–10). Strip direhidrasi dengan sampel, kemudian difokuskan pada tegangan yang meningkat (300–8000 V) selama beberapa jam hingga puluhan kilovolt-jam. Protein bermigrasi ke pH di mana muatan bersihnya nol — titik isoelektriknya. Strip yang telah difokuskan diequilibrasi dalam DTT (reduksi) diikuti oleh iodoasetamida (alkilasi) sebelum dimensi kedua.
Dimensi Kedua — SDS-PAGE
Strip yang telah diequilibrasi ditempatkan di atas gel poliakrilamida dan disegel dengan agarosa. Protein berlapis-SDS bermigrasi secara vertikal melalui gel, memisah berdasarkan berat molekul. Gel Laemmli standar atau gel gradien (mis., 8–16% akrilamida) meningkatkan resolusi di seluruh rentang massa. Penanda berat molekul dimuat di salah satu ujung. Protein divisualisasikan dengan Coomassie Brilliant Blue, pewarnaan perak, SYPRO Ruby, atau pelabelan fluoresen.
Persiapan Sampel
Kualitas sampel sangat penting untuk gel 2D yang reprodusibel. Inhibitor protease dan fosfatase sangat penting. Protein diendapkan dengan TCA/aseton atau menggunakan kit pembersihan untuk menghilangkan garam, lipid, dan asam nukleat yang mengganggu fokus. Sampel dikuantifikasi dengan uji Bradford atau BCA. Untuk protein membran, deterjen tambahan atau pelarut organik meningkatkan solubilisasi.
Deteksi dan Analisis
Gel dipindai secara densitometrik dan dianalisis dengan perangkat lunak seperti PDQuest, Delta2D, atau Melanie. Deteksi bercak, pencocokan antar gel, dan normalisasi menghasilkan data kelimpahan kuantitatif. Bercak yang diekspresikan secara diferensial diidentifikasi oleh uji statistik. Bercak yang menarik dipotong dan diidentifikasi oleh spektrometri massa setelah digesti tripsin dalam gel.
Kelebihan dan Keterbatasan
2D-PAGE meresolusi protein utuh dengan modifikasi pasca-translasi, yang menggeser bercak secara horizontal (fosforilasi, asetilasi) atau vertikal (glikosilasi). Batas deteksi adalah 1 ng per bercak dengan pewarnaan perak dan 100 ng dengan Coomassie. Keterbatasan meliputi representasi buruk protein yang sangat asam atau basa (pI < 3 atau > 10), protein membran (hidrofobisitas menggumpal selama fokus), protein dengan berat molekul sangat tinggi dan rendah (> 200 kDa atau < 10 kDa), dan protein kelimpahan rendah yang berada di bawah deteksi. Reproduksibilitas memerlukan standarisasi yang cermat di semua langkah.
Aplikasi
2D-PAGE adalah landasan proteomik untuk analisis ekspresi diferensial, membandingkan jaringan sehat dan sakit, garis sel yang diolah dan tidak diolah, atau tahap perkembangan. Ini memetakan isoform protein dan modifikasi pasca-translasi, menyediakan gambaran singkat proteom fungsional. Elektroforesis gel perbedaan 2D menggunakan pelabelan CyDye (Cy3, Cy5, Cy2) untuk menjalankan dua atau tiga sampel dalam gel yang sama, menghilangkan variabilitas gel-ke-gel dan meningkatkan akurasi kuantitatif.
