Spektroskopi UV-Vis (Ultraviolet-Visible) adalah teknik analisis yang mengukur penyerapan cahaya di wilayah spektrum elektromagnetik ultraviolet (190-400 nm) dan tampak (400-800 nm). Ini banyak digunakan untuk analisis kuantitatif, studi kinetik, dan karakterisasi transisi elektronik dalam molekul.

Prinsip Penyerapan UV-Vis

Ketika cahaya melewati sampel, molekul menyerap foton yang energinya sesuai dengan kesenjangan energi antara orbital elektronik, sehingga mendorong elektron dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi. Jumlah cahaya yang diserap pada setiap panjang gelombang dicatat sebagai spektrum serapan, dan panjang gelombang serapan maksimum (λmaks) merupakan karakteristik masing-masing kromofor. Hukum Beer-Lambert (A = εcl) menghubungkan serapan (A) dengan absorptivitas molar (ε), panjang jalur (c), dan konsentrasi (l), memungkinkan kuantifikasi.

Instrumentasi

Spektrometer UV-Vis terdiri dari beberapa komponen. Lampu deuterium memberikan cahaya untuk rentang UV dan lampu tungsten-halogen untuk rentang cahaya tampak. Monokromator (kisi difraksi atau prisma) memilih pita panjang gelombang yang sempit. Kompartemen sampel menampung kuvet kuarsa untuk pengukuran UV atau kuvet kaca untuk pengukuran rentang tampak, dan detektor (tabung pengganda foto atau susunan fotodioda) mengubah cahaya yang ditransmisikan menjadi sinyal listrik. Instrumen sinar ganda membagi cahaya menjadi berkas sampel dan berkas referensi untuk mengoreksi fluktuasi pelarut dan lampu.

Aplikasi

Spektroskopi UV-Vis digunakan untuk analisis kuantitatif asam nukleat (A260), protein (A280), dan kinetika enzim, penentuan nilai pKa dengan mengukur perubahan serapan dengan pH, pengendalian kualitas obat-obatan, pewarna makanan, dan polutan air, serta karakterisasi kompleks logam transisi dan senyawa organik terkonjugasi.

Kelebihan dan Keterbatasan

• Keunggulan: Cepat, tidak merusak, memerlukan volume sampel yang kecil, dan relatif murah.
• Keterbatasan: Hanya mengukur spesies kromoforik; sampel harus transparan dan bebas dari partikel yang berhamburan.

Protokol Spektroskopi UV-Vis Praktis

Panaskan instrumen selama 15–30 menit untuk menstabilkan lampu. Pilih kuvet kuarsa untuk pengukuran UV (<350 nm) karena kaca dan plastik menyerap sinar UV; gunakan kuvet plastik atau kaca sekali pakai hanya untuk pengukuran jarak tampak. Pegang kuvet pada sisi yang buram untuk menghindari sidik jari pada jendela optik. Isi kuvet referensi dengan larutan kosong (pelarut atau buffer saja) dan kuvet sampel dengan larutan analit. Masukkan kuvet referensi pada jalur berkas referensi dan sampel pada jalur berkas sampel. Untuk instrumen sinar tunggal, kumpulkan spektrum dasar blanko terlebih dahulu, lalu ganti dengan sampel. Lakukan pemindaian panjang gelombang dari 200–800 nm dengan kecepatan sedang (200 nm/menit) untuk menentukan λmaks — panjang gelombang serapan maksimum. Untuk analisis kuantitatif pada panjang gelombang tetap, atur instrumen ke λmax analit. Ukur serapan serangkaian larutan standar (konsentrasi 5–7 yang mencakup kisaran yang diharapkan) dan sampel yang tidak diketahui. Buatlah kurva kalibrasi dengan memplot serapan vs. konsentrasi. Cocokkan regresi linier — hukum Beer-Lambert (A = εbc) menyatakan bahwa hubungan harus linier dengan titik potong mendekati nol, asalkan serapannya antara 0,1 dan 1,0 (rentang linier pada sebagian besar instrumen). Jika serapannya melebihi 1,0, encerkan sampel. Untuk kuantifikasi DNA pada 260 nm, gunakan koefisien kepunahan 50 ng/µL per unit OD untuk DNA untai ganda dan 33 ng/µL per unit OD untuk DNA untai tunggal. Kemurnian dinilai dengan rasio A260/A280 (~1,8 untuk DNA murni, ~2,0 untuk RNA murni) dan rasio A260/A230 (>2,0). Untuk kuantifikasi protein pada 280 nm, ukur A280 dari protein yang dimurnikan dan hitung konsentrasinya menggunakan koefisien kepunahan molar protein. Untuk kinetika enzim, pantau perubahan serapan seiring waktu pada panjang gelombang tetap — misalnya, konsumsi NADH pada 340 nm (ε = 6220 M⁻¹cm⁻¹) untuk mengukur aktivitas dehidrogenase.

Aplikasi Dunia Nyata

Dalam studi tentang enzim alkohol dehidrogenase, oksidasi etanol menjadi asetaldehida digabungkan dengan reduksi NAD⁺ menjadi NADH, yang menyerap pada 340 nm. Reaksi dipantau pada 340 nm selama 5 menit pada 30°C dengan 0,1–10 mM etanol. Kecepatan awal diplot vs. konsentrasi substrat dan disesuaikan dengan persamaan Michaelis-Menten, menghasilkan Km = 1,2 mM dan Vmax = 85 µM/mnt.