Kristalografi sinar-X menentukan struktur atom tiga dimensi protein dan makromolekul lain dengan mengukur sudut dan intensitas sinar-X yang difraksikan oleh kristal, kemudian menghitung peta densitas elektron dari mana model atom dibangun.
Prinsip
Ketika sinar-X mengenai kristal, mereka dihamburkan oleh awan elektron atom. Kisi kristal yang teratur secara berkala menyebabkan interferensi konstruktif — difraksi — pada sudut spesifik yang dijelaskan oleh hukum Bragg. Mengukur posisi dan intensitas titik difraksi memungkinkan rekonstruksi distribusi densitas elektron. Peta densitas ini kemudian diinterpretasikan dengan menyesuaikan model atom, yang disempurnakan terhadap data yang diamati.
Kristalisasi Protein
Difraksi memerlukan kristal dengan keteraturan tiga dimensi yang teratur. Protein dimurnikan hingga kemurnian >95% pada 5–20 mg/mL. Layar kristalisasi menguji ratusan kondisi yang bervariasi dalam pengendap (PEG, amonium sulfat), pH, buffer, garam, dan aditif. Difusi uap tetes-duduk dan tetes-gantung adalah metode standar. Tetesan protein dan larutan reservoir menyeimbangkan terhadap reservoir yang lebih besar, memekatkan protein dan mendorong nukleasi. Kristal yang sesuai untuk difraksi tumbuh selama berhari-hari hingga berminggu-minggu dan dipanen dengan cryo-loop.
Pengumpulan Data
Kristal didinginkan cepat dalam nitrogen cair pada 100 K untuk mengurangi kerusakan radiasi. Data difraksi dikumpulkan di garis pancaran sinkrotron, yang menyediakan berkas sinar-X yang intens dan dapat disetel. Dataset lengkap terdiri dari ratusan hingga ribuan gambar difraksi yang dikumpulkan saat kristal berputar melalui rentang sudut kecil per gambar. Pemrosesan data dengan XDS, iMosflm, atau DIALS mengindeks refleksi, mengintegrasikan intensitas, dan menskalakan pengukuran. Batas resolusi didefinisikan oleh refleksi sudut tertinggi dengan intensitas terukur; 2,0–3,0 Å tipikal untuk struktur protein.
Masalah Fase
Intensitas terukur memberikan amplitudo tetapi tidak fase, yang penting untuk transformasi Fourier yang merekonstruksi densitas elektron. Penggantian molekul memecahkan fase dengan menempatkan model struktur homolog dalam unit sel kristalografi dan menghitung difraksi prediksinya, yang menyediakan fase awal. Ketika tidak ada model pencarian yang baik, pentahapan eksperimental menggunakan turunan atom berat (MIRAS) atau incorporasi selenium melalui selenometionin (MAD/SAD). Jalur pipa modern mengotomatiskan sebagian besar proses ini.
Pembangunan dan Penyempurnaan Model
Peta densitas elektron awal diinterpretasikan dalam Coot atau perangkat lunak serupa, di mana rantai polipeptida dilacak dan rantai samping ditempatkan. Model mengalami siklus iteratif penyesuaian manual dan penyempurnaan komputasional dengan phenix.refine atau REFMAC5. Penyempurnaan mengoptimalkan model untuk meminimalkan perbedaan antara faktor struktur yang dihitung dan diamati. Kualitas dipantau oleh Rwork dan Rfree. Struktur yang andal biasanya memiliki Rfree di bawah 0,25 pada resolusi 2,5 Å.
Validasi
MolProbity memvalidasi geometri tulang punggung, pencilan rotamer, skor benturan, dan statistik Ramachandran. Korelasi antara model dan densitas elektron eksperimental dinilai oleh real-space R-factor. Laporan validasi PDB, yang dihasilkan untuk semua deposisi, menyediakan ringkasan kualitas terstandarisasi. Kriteria yang direkomendasikan: >90% Ramachandran favored, <0,3% Ramachandran outliers, <1% rotamer outliers.
Aplikasi
Kristalografi sinar-X telah menentukan mayoritas struktur protein yang diketahui di Protein Data Bank. Teknik ini telah menjelaskan mekanisme katalitik enzim, interaksi obat-target termasuk protease HIV dan inhibitor kinase, dan kompleks makromolekul besar seperti ribosom. Bersama dengan spektroskopi NMR dan krio-EM, ia membentuk perangkat inti biologi struktural.
