Zimografi adalah teknik elektroforetik yang mendeteksi aktivitas enzimatik protease, lipase, glikosidase, dan enzim hidrolitik lainnya. Aplikasi paling umum adalah mendeteksi aktivitas matrix metalloproteinase (MMP) dalam sampel biologis.

Prinsip

Sampel protein dipisahkan oleh SDS-PAGE dalam kondisi non-reduksi (tanpa DTT atau β-merkaptoetanol, ini akan menghancurkan aktivitas enzim). Gel resolving diko-polimerisasi dengan substrat, biasanya gelatin (0,1% b/v) untuk deteksi MMP-2 dan MMP-9, atau kasein untuk deteksi protease yang lebih luas. Setelah elektroforesis, SDS dihilangkan dengan mencuci dalam larutan Triton X-100, memungkinkan protease untuk renaturasi. Gel kemudian diinkubasi dalam buffer pengembangan pada 37 °C selama 12–48 jam, di mana protease aktif mencerna substrat di sekitarnya. Setelah pewarnaan dengan Coomassie Blue, pita jernih muncul dengan latar belakang biru gelap di mana substrat telah dicerna.

Protokol

1. Siapkan gel resolving dengan 0,1% gelatin atau kasein ditambahkan ke larutan akrilamida (8–10% akrilamida adalah standar untuk MMPs). Sertakan gel stacking tanpa substrat.
2. Muat sampel tanpa direbus dan tanpa agen pereduksi. Gunakan buffer sampel non-reduksi (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 25% gliserol, 2% SDS, 0,01% bromofenol biru).
3. Jalankan pada 100–150 V pada 4 °C untuk mencegah proteolisis selama elektroforesis.
4. Cuci gel dalam buffer renaturasi (2,5% Triton X-100 dalam 50 mM Tris-HCl pH 7,5) selama 2 × 30 menit pada suhu ruang dengan pengocokan lembut.
5. Cuci sebentar dalam buffer pengembangan (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃, 1 µM ZnCl₂).
6. Inkubasi dalam buffer pengembangan pada 37 °C selama 12–48 jam.
7. Warnai dengan Coomassie Blue R-250 (0,5% dalam 30% metanol, 10% asam asetat) selama 1 jam.
8. Destain (30% metanol, 10% asam asetat) sampai pita jernih terlihat.
9. Citrakan gel dan kuantifikasi pita dengan densitometri.

Interpretasi

Pita muncul sebagai zona jernih dengan latar belakang biru. Posisinya menunjukkan berat molekul (dengan perbandingan terhadap standar protein), dan intensitasnya sebanding dengan jumlah enzim aktif. Berat molekul pita jernih harus sesuai dengan bentuk pro atau aktif dari protease yang diharapkan. Misalnya, pro-MMP-9 muncul pada ~92 kDa, MMP-9 aktif pada ~82 kDa, pro-MMP-2 pada ~72 kDa, dan MMP-2 aktif pada ~62 kDa.

Zimografi Terbalik

Untuk mendeteksi inhibitor protease (TIMPs, tissue inhibitors of metalloproteinases), gel diko-polimerisasi dengan substrat dan protease standar (misalnya, medium terkondisi dari sel HT-1080 yang mengandung MMPs aktif). Setelah pengembangan dan pewarnaan, pita inhibitor muncul sebagai area gelap (terwarnai) di mana substrat tidak dicerna, dengan latar belakang jernih di mana protease yang ditambahkan mencerna substrat di tempat lain.

Aplikasi

Zimografi digunakan untuk mengukur aktivitas MMP dalam ekstrak tumor, cairan luka, cairan sinovial, dan supernatan kultur sel. Ini adalah uji standar dalam biologi kanker (MMPs mendorong invasi dan metastasis), penyakit kardiovaskular (remodeling plak), dan remodeling jaringan. Zimografi kuantitatif dimungkinkan dengan standar MMP murni yang dimuat pada gel yang sama.

Keterbatasan

Zimografi mendeteksi total aktivitas proteolitik pada berat molekul tersebut, tidak selalu satu enzim, beberapa protease dapat bermigrasi bersama. Ini juga tidak benar-benar kuantitatif dalam arti absolut (kinetika digesti substrat bervariasi antar enzim). Untuk pengukuran aktivitas spesifik, uji aktivitas berbasis ELISA atau uji pembelahan substrat FRET lebih disukai.