分离纯培养物后，下一步是鉴定。传统的生化检测评估代谢能力，而现代自动化系统加速并标准化了这一过程。

核心生化检测

• 过氧化氢酶：检测分解过氧化氢的过氧化氢酶。3% H₂O₂ 滴在菌落上数秒内产生气泡为阳性。葡萄球菌阳性；链球菌阴性。
• 氧化酶：检测细胞色素 c 氧化酶。菌落涂在浸有氧化酶试剂的滤纸上，10–30 秒内变为深紫色为阳性。奈瑟菌和假单胞菌阳性；肠杆菌科阴性。
• 凝固酶：区分金黄色葡萄球菌（阳性）与其他葡萄球菌。混合菌落与兔血浆，检查 4–24 小时内的凝块形成。
• 吲哚：某些细菌从色氨酸产生吲哚。吲哚与 Kovac 试剂反应产生红色层。
• 甲基红 / Voges–Proskauer（MR/VP）：MR 检测混合酸发酵；VP 检测丁二醇发酵途径。经典用于区分大肠杆菌（MR⁺、VP⁻）和肠杆菌/克雷伯菌（MR⁻、VP⁺）。
• 柠檬酸利用：使用柠檬酸作为唯一碳源的细菌产生氨，使溴百里酚蓝从绿色变为蓝色。肺炎克雷伯菌阳性；大肠杆菌阴性。
• TSI（三糖铁）琼脂：检测葡萄糖、乳糖和蔗糖发酵、产气和 H₂S 产生的斜面。酸/碱反应模式和黑色沉淀对肠道细菌具有特征性。

小型化系统（API 试条）

API 系统在塑料试条中小型化 20–50 个生化检测。每个检测是一个杯中的脱水底物。用标准化的细菌悬液接种试条，孵育 18–24 小时，根据颜色变化读取反应。生成的 7 或 9 位数字编码在数据库中查询以鉴定微生物。

自动化系统

• VITEK：使用含有 30–60 个生化反应的塑料卡。将细菌悬液装入卡中，密封并每 15 分钟自动读取。2–8 小时内生成鉴定结果。VITEK 2 还提供药敏试验。
• MALDI-TOF MS：可用的最快速鉴定方法。将细菌菌落点样到靶板上，覆盖基质，通过质谱分析。生成的蛋白质谱与数据库比较，每个样品在不到一分钟内提供种水平鉴定。

MALDI-TOF 因其速度、准确性和低耗材成本，在临床微生物实验室中已基本取代生化检测。它从单个菌落鉴定细菌、酵母和真菌，无需事先了解微生物。