毛细管凝胶电泳（CGE）是毛细管电泳的一种模式，其中分离毛细管充满聚合物凝胶或线性聚合物溶液作为筛分介质。通过基质的分子迁移会根据其大小而受到阻碍——较小的物质在聚合物网络中移动得更快，而较大的物质则越来越受到阻碍。 CGE 可实现长达约 500 个碱基的 DNA 片段的单碱基分辨率，是现代 DNA 测序和法医 DNA 分析的核心分离技术。它还广泛用于变性条件下的蛋白质大小和纯度分析 (SDS-CGE)，为经典平板凝胶 SDS-PAGE 提供自动化、定量的替代方案。

筛分矩阵

CGE 中的筛分基质取代了传统电泳中使用的平板凝胶。早期的 CGE 方法采用在毛细管内聚合的交联聚丙烯酰胺凝胶，但这些凝胶在结垢时难以更换，并且在高电场下稳定性有限。现代 CGE 绝大多数使用可替换的线性聚合物溶液，通常是线性聚丙烯酰胺 (LPA)、聚环氧乙烷 (PEO) 或支链淀粉衍生物。这些聚合物以一定浓度溶解在分离缓冲液中，形成缠结网络，其孔径由聚合物链长度和浓度决定。每次运行后，聚合物溶液都会从毛细管中冲洗出来，并用新鲜的基质替换，从而消除残留并能够进行数百次连续分析。聚合物类型和浓度的选择决定了有效的筛分范围 - 低浓度 LPA (2–4%) 可解析高达 20 kb 的大 DNA 片段，而较高浓度 (5–7%) 则可提供高达 600–1000 个碱基的 DNA 测序所需的单碱基分辨率。

分离原理

在 CGE 中，分离仅取决于在消除二级结构的变性条件下的分子大小。对于 DNA 分析，样品通过热和甲酰胺变性，并在尿素或其他变性剂存在的情况下在高温 (40–70°C) 下进行分离。在这些条件下，DNA片段以随机卷曲的形式迁移，它们的电泳迁移率与其分子量的对数成反比。迁移时间和片段长度之间的关系在定义的尺寸窗口内近似线性，从而可以通过与添加到每个样品的内部尺寸标准进行比较来精确确定尺寸。对于蛋白质分析 (SDS-CGE)，使用十二烷基硫酸钠 (SDS) 和二硫苏糖醇 (DTT) 或 2-巯基乙醇等还原剂使蛋白质变性。 SDS 以每克蛋白质约 1.4 g SDS 的恒定质量比与蛋白质结合，从而产生均匀的负电荷密度。然后，SDS 包被的蛋白质严格按照其分子量迁移通过聚合物基质，迁移率和质量之间具有与控制 SDS-PAGE 相同的对数线性关系。

仪表和操作

CGE 仪器与通用毛细管电泳系统具有相同的核心组件——高压电源、缓冲液储槽、熔融石英毛细管和检测器——但针对粘性聚合物基质的操作进行了优化。毛细管内部通常有涂层，以抑制电渗流并减少分析物对二氧化硅壁的吸附。每次运行前使用高压泵或气体驱动筒将聚合物溶液填充到毛细管中，然后将其排出。通过电动注射进行样品引入，其中施加电压以将带电分析物驱动到毛细管尖端。这种注射模式本质上偏向于更小、更易移动的物种，但提供了痕量 DNA 和蛋白质分析所需的灵敏度。对于高通量操作，并行采用多毛细管阵列（96 或 384 根毛细管），每天在法医 DNA 案例和临床测序等应用中处理数百个样本。

检测方法

激光诱导荧光 (LIF) 检测是 CGE 中的主要检测方法，提供 DNA 测序和法医分析所需的阿托摩尔到泽托摩尔灵敏度。 DNA 片段用嵌入染料标记，这些染料在与双链 DNA 结合时发出荧光，或者用共价连接的荧光染料（例如 FAM、JOE、ROX）标记，以便在测序中实现单碱基分辨率。多色 LIF 检测使用多个激光器和发射滤光片，可以在一次运行中区分多种染料 - 四色检测是桑格测序的标准配置，五色或六色系统用于法医短串联重复序列 (STR) 分析。紫外吸光度检测是蛋白质和合成聚合物等未标记分析物的替代方法，但其灵敏度受到毛细管短光程长度（通常为 50–100 µm）的限制。

DNA 测序中的应用

CGE 是现代桑格 DNA 测序的分离引擎。在典型的工作流程中，循环测序反应产生终止于每个核苷酸位置的荧光标记片段的混合物。这些片段被注入充满 LPA 筛分基质的 CGE 毛细管中，并在变性条件下按大小分离。当每个片段通过 LIF 检测器时，其颜色可识别末端碱基，仪器会记录四色电泳图，从中调用 DNA 序列。 Applied Biosystems 3730 和 3500 系列等商业平台每次运行的读长可达 600-1000 个碱基，碱基识别准确度在共识水平上超过 99.99%。尽管下一代测序主导了发现规模项目，但基于 CGE 的桑格测序仍然是序列验证、突变检测和临床诊断测序的黄金标准。

法医 DNA 分析中的应用

法医 DNA 分析依赖于 PCR 扩增的短串联重复 (STR) 位点的 CGE 分离。商业多重试剂盒可在一次反应中扩增 15 至 27 个 STR 标记以及牙釉蛋白性别决定标记。荧光标记的扩增子通过 CGE 和多色 LIF 检测进行分离，并通过与内部大小标准比较来确定等位基因大小。 CGE 的分辨能力（在 100-500 bp 的大小范围内优于一个碱基对）能够区分单个重复单元（四核苷酸重复为 4 bp）不同的等位基因。所得到的 DNA 图谱会在国家和国际数据库中进行搜索，以进行人类身份识别。 CGE 还用于线粒体 DNA 测序以及 Y 染色体和 X 染色体 STR 分析，以用于专门的法医应用。 CGE 的自动化、通量和重现性使其成为全球法医 DNA 分析的通用平台。

蛋白质分析中的应用

SDS-CGE 是平板凝胶 SDS-PAGE 的自动化定量替代品，用于蛋白质大小和纯度分析。用 SDS 和还原剂使蛋白质变性，用荧光染料标记（用于 LIF 检测）或通过 UV 吸光度检测，然后在线性聚合物基质中分离。使用从蛋白质标准品生成的校准曲线将每种蛋白质的迁移时间转换为分子量。与平板凝胶电泳相比，SDS-CGE 具有多种优势：微流体格式中每个样品的分析时间为 30-60 秒，毛细管系统中的分析时间为 5-15 分钟，通过峰面积积分精确定量相对蛋白质丰度，以及直接与质谱联用进行蛋白质鉴定。它广泛用于生物制药质量控制，用于监测产品纯度、糖基化谱以及治疗性蛋白质和抗体的片段化。 SDS-CGE 的蛋白质大小范围约为 10-250 kDa，分辨率足以区分分子量差异 5-10% 的蛋白质种类。

与平板凝胶电泳的比较

与传统平板凝胶电泳相比，CGE 具有根本优势。毛细管形式可提供高效的散热，从而实现更高的电场强度和更快的分离。检测在柱上实时进行，消除了平板凝胶所需的染色、脱色和成像步骤。可更换的聚合物基质避免了凝胶注模的劳力，并实现了自动化的多次运行操作。定量更加准确，因为检测在宽动态范围内呈线性，并且峰面积以电子方式积分。然而，平板凝胶对于必须切除单个条带的制备分离、二维电泳 (2D-PAGE) 工作流程以及 CGE 仪器资本成本过高的实验室仍然有用。 CGE 和平板凝胶电泳是互补的工具，它们之间的选择取决于特定应用的通量、定量和自动化要求。