细胞培养是研究细胞生理学、生产重组蛋白、测试候选药物和制造细胞疗法的基本技术。成功取决于无菌技术、适当的培养基和受控的环境条件。

生物安全与无菌技术

所有细胞培养工作均在 II 级生物安全柜（BSC）中使用无菌技术进行。BSC 通过 HEPA 过滤器过滤空气并产生向下层流气流，同时保护操作者和培养物。

关键无菌操作：

• 将所有物品放入 BSC 前用 70% 乙醇喷洒。
• 不要遮挡安全柜前部或后部的空气格栅。
• 从清洁到污浊的方向操作——将试剂放在一侧，废料放在另一侧。
• 切勿触碰瓶盖内侧或无菌瓶的瓶口边缘。
• 接触非无菌物品后更换手套。

生长培养基

大多数哺乳动物细胞在提供营养物质、生长因子和 pH 缓冲系统的复合培养基中培养。常用配方：

• DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）：高糖（4.5 g/L）或低糖（1 g/L）。用于 HeLa、HEK 293、成纤维细胞。
• RPMI-1640：为悬浮细胞和淋巴细胞开发。常用于造血细胞和杂交瘤细胞。
• F-12 / Ham’s F-12：用于无血清克隆和 CHO 细胞的丰富培养基。
• FBS（胎牛血清）：以 5–20%（通常 10%）添加，提供生长因子、激素和粘附因子。批次差异会影响可重复性——应测试并保留一致的批次。

环境控制

哺乳动物细胞在 37 °C、含 5% CO₂ 的潮湿大气中培养。CO₂ 溶解在培养基中形成碳酸，与碳酸氢盐缓冲系统共同维持 pH 约 7.4。培养箱加湿盘应装入无菌水并定期清洁，以防止霉菌和细菌滋生。

细胞类型

• 贴壁细胞：附着在培养容器上（如 HeLa、HEK 293、MDCK、原代成纤维细胞）。传代需要胰蛋白酶消化。
• 悬浮细胞：在培养基中漂浮生长（如 Jurkat、HL-60、许多杂交瘤细胞）。通过添加新鲜培养基稀释传代。
• 原代细胞：直接从组织中分离。寿命有限。更接近生理状态，但培养难度更大。
• 永生化细胞系：来源于肿瘤或体外转化。可无限传代，但可能在遗传上与原始组织存在差异。

传代

贴壁细胞在达到 70–90% 融合度时进行传代。标准操作：去除培养基，用 PBS（无 Ca²⁺/Mg²⁺）洗涤，加入胰蛋白酶-EDTA，在 37 °C 孵育 2–5 分钟直至细胞脱落，加入新鲜培养基中和胰蛋白酶，计数，按适当密度重新接种。

每次记录传代次数。细胞应在确定的传代窗口内使用（例如，大多数永生化细胞系为第 3–20 代），以最小化表型漂移。