柠檬酸循环，也称为克雷布斯循环或 TCA 循环，是细胞代谢的中心枢纽。它发生在线粒体基质中，通过将乙酰辅酶A转化为二氧化碳来完成碳水化合物、脂肪和蛋白质的氧化。
柠檬酸循环如何工作
- 入口：柠檬酸盐地层
乙酰辅酶A（源自丙酮酸、脂肪酸 或氨基酸）与草酰乙酸（一种四碳分子）结合形成柠檬酸盐（一种六碳分子）。该反应由柠檬酸合酶催化，基本上是不可逆的。
- 异构化和第一次氧化
柠檬酸通过中间体顺乌头酸异构化为异柠檬酸。然后异柠檬酸被异柠檬酸脱氢酶氧化，释放出第一个 CO2 分子并产生 NADH。该产品是α-酮戊二酸，一种五碳分子。
3.二次氧化
α-酮戊二酸被α-酮戊二酸脱氢酶氧化，释放第二种CO2并产生NADH。该反应类似于丙酮酸脱氢酶反应并产生琥珀酰辅酶A。
- 底物水平磷酸化
琥珀酰辅酶A通过琥珀酰辅酶A合成酶转化为琥珀酸。该反应通过底物水平磷酸化产生 GTP（或某些生物体中的 ATP）——这是循环中唯一直接产生 ATP 的步骤。
- 草酰乙酸的再生
琥珀酸被琥珀酸脱氢酶氧化为富马酸，产生 FADH2。然后富马酸水合成苹果酸，苹果酸被苹果酸脱氢酶氧化成草酰乙酸，产生另一种NADH。再生的草酰乙酸可以与另一种乙酰辅酶A结合。
- 每转净产量
循环的每一圈都会产生：
- 3 辅酶ADH
- 1 FADH2
- 1 GTP（或 ATP）
- 2 二氧化碳
TCA 循环中间体的实际测量
TCA 循环中间体可以通过液相色谱-质谱 (LC-MS) 进行定量，以评估代谢通量。通过在冰冷的 80% 甲醇中快速淬灭以停止代谢来收获细胞 (1–5 × 10⁶) 或组织 (10–50 mg)。添加含有 13 C 标记的柠檬酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、苹果酸盐和 α-酮戊二酸盐同位素异数体（各 1 nmol）的内标混合物。在 80% 甲醇中通过三个冻融循环提取代谢物，在 4°C 下以 15,000 × g 离心 10 分钟，并在氮气下干燥上清液。在 50 µL 水中重新溶解，并将 5 µL 注射到与在负离子模式下运行的三重四极杆 MS 耦合的 C18 柱（2.1 × 100 mm，1.7 µm）上。使用水（0.1% 甲酸）和乙腈以 0.3 mL/min 的梯度分离 15 分钟。监测特定 MRM 转变：柠檬酸盐 (191 → 111 m/z)、琥珀酸盐 (117 → 73 m/z)、富马酸盐 (115 → 71 m/z)、苹果酸盐 (133 → 115 m/z) 和 α-酮戊二酸盐 (145 → 101 m/z)。对于通量分析，将细胞与 [U-13C] 葡萄糖一起孵育 6 小时； TCA 中间体中的标记模式揭示了葡萄糖与谷氨酰胺作为碳源的相对贡献。或者，使用化学抑制剂作为代谢探针 - 氟柠檬酸盐 (10–50 µM) 抑制乌头酸酶，阻断柠檬酸盐循环，并导致 LC-MS 在 2 小时内可测量到柠檬酸盐积累。
实际应用
在大鼠心脏缺血再灌注损伤的研究中，通过 LC-MS 测量 TCA 循环中间体。与对照组相比，缺血心脏的琥珀酸盐减少了 60%，富马酸盐增加了 3 倍，表明复合物 II 功能障碍。再灌注后，琥珀酸氧化的爆发有助于活性氧的产生。这些发现将 TCA 循环中断与心脏损伤联系起来，并建议琥珀酸作为治疗靶点。
