CRISPR/Cas9用于编辑单个基因，而CRISPR筛选则将基因组工程扩展到整个基因组的一次实验，鉴定赋予抗性、敏感性或特定表型的基因。

原理

混合CRISPR筛选使用靶向基因组中每个基因（或聚焦子集）的向导RNA（sgRNA）序列文库。每个sgRNA引导Cas9在特定基因组位点产生双链断裂，造成基因敲除。通过追踪在筛选条件下哪些sgRNA在群体中富集或耗竭，筛选鉴定出功能相关的基因。

文库设计

全基因组CRISPR文库（Brunello、TKOv3、GeCKO）包含每个基因4–6个sgRNA，加上100–1000个非靶向对照。每个sgRNA是一条20 nt的序列，靶向基因组中PAM邻近的位点。该文库作为寡核苷酸池合成，克隆到慢病毒载体中，并包装成慢病毒。

筛选流程

1. 转导：以低感染复数（MOI约0.3）用慢病毒sgRNA文库感染表达Cas9的细胞，使大多数细胞只接受一个sgRNA。使用足够数量的细胞以维持每个sgRNA约500×的代表性。
2. 筛选：转导后48小时，加入嘌呤霉素（或其他筛选抗生素）以筛选已整合文库的细胞。
3. 表型筛选：培养7–14天后，施加实验条件：药物处理、毒素暴露、饥饿或基于报告基因分选细胞。平行对照组在不进行筛选的情况下培养。
4. 测序：从两个群体中提取基因组DNA，PCR扩增sgRNA编码区，在Illumina平台上测序。
5. 分析：将读数比对齐到文库参考序列，计数每个基因的sgRNA，计算筛选组和对照组之间的倍数变化。sgRNA显著耗竭的基因是该条件下生存所必需的；富集的sgRNA指示抗性基因。

关键考虑因素

• 代表性：在整个筛选过程中维持每个sgRNA至少500个细胞，以避免掉落假象。
• Cas9表达：细胞必须高表达Cas9。首选稳定表达Cas9的细胞系或Cas9敲入细胞系。
• 对照：包括毒性对照（例如，高剂量药物）以确认耗竭是特异性的，以及无筛选对照以考虑sgRNA本身的生长效应。

应用

CRISPR筛选已被用于鉴定化疗、靶向治疗和免疫治疗的耐药机制；发现病毒感染所需的宿主因子；绘制癌症中的合成致死相互作用；以及鉴定调控细胞分化、迁移和代谢的基因。

与shRNA筛选的比较

CRISPR筛选产生完全敲除（移码突变）而非敲低（mRNA降解），从而提供更一致和完全的功能丧失。由于更长的靶向序列（20 nt vs. 19 nt）以及需要PAM序列，其脱靶效应少于shRNA。然而，CRISPR筛选仅限于蛋白质编码基因，而shRNA筛选可以靶向非编码RNA。