低温保存是将活细胞、组织或微生物保存在超低温下（通常为 −80 °C 或 −196 °C 液氮）的过程，使其保持活力以备将来使用。管理良好的细胞库可确保多年的实验可重复性。

原理

冰晶形成是冷冻过程中细胞死亡的主要原因。细胞内冰会刺穿膜并破坏细胞器。冷冻保护剂通过以下方式保护细胞：

• 穿透细胞（如 DMSO、甘油）以置换水分并降低冰点。
• 非穿透性（如蔗糖、Ficoll）在冷冻前使细胞脱水。

冷却速率必须平衡两种竞争效应：过慢会导致长期暴露于浓缩溶质而引起的渗透损伤；过快会导致致命的细胞内冰。大多数哺乳动物细胞以 −1 °C/分钟的速率优化冷却。

冷冻保护剂

• DMSO（二甲基亚砜）：使用最广泛的 CPA。典型浓度为 5–10%（v/v），在含 10–20% FBS 的培养基或无血清冷冻培养基中。DMSO 在室温下随时间推移对细胞有毒——操作要迅速并保持细胞在冰上。
• 甘油：10–20%（v/v）。毒性低于 DMSO 但穿透性较弱。常用于细菌、酵母和某些细胞系。
• 无血清冷冻培养基：商业配方使用确定的 CPA，不含动物血清。

冷冻操作

1. 在对数期收获细胞，活力 >90%。
2. 计数并在 200–300 × g 下离心 5 分钟。
3. 在冷冷冻培养基中重悬，浓度为 1–5 × 10⁶ 细胞/mL。
4. 分装到冷冻管中（每管 1 mL）。标记细胞系、传代数、日期和操作者。
5. 使用控速冷冻器、异丙醇冷冻容器或被动冷却装置以 −1 °C/分钟冷却。
6. 转移到 −80 °C 24 小时（短期），然后移入液氮（−196 °C）长期储存。

解冻操作

1. 从储存中取出冷冻管，立即放入 37 °C 水浴中轻轻搅拌。
2. 解冻至仅剩一小块冰晶（约 1–2 分钟）。
3. 用 70% 乙醇擦拭冷冻管。
4. 将内容物逐滴加入 10 mL 预热培养基中。
5. 在 200 × g 下离心 5 分钟以去除 DMSO，重悬于新鲜培养基中，接种。

细菌和酵母的低温保存

细菌和酵母较易保存。将过夜培养物与无菌 50% 甘油按 1:1 在冷冻管中混合，涡旋，在 −80 °C 下冷冻。复苏时，用无菌接种环刮取冷冻菌种表面，在琼脂平板上划线——不要解冻整个菌种。

良好细胞库操作规范

• 在尽可能低的传代数下创建主细胞库（MCB），然后从 MCB 衍生工作细胞库（WCB）。
• 测试 MCB 的支原体、细菌污染和身份（人源细胞系进行 STR 分型）。
• 将 MCB 冷冻管储存在两个物理分离的位置。
• 监测液氮水平并维护温度记录。