酶动力学是对酶催化生化反应速率的研究。通过测量反应速度如何随底物浓度变化，科学家可以确定描述酶活性和效率的关键参数。

酶动力学的关键概念

反应速度

酶催化反应的速度以每单位时间形成的产物量来测量。初速度 (V0) 在反应开始时测量，此时底物浓度远高于产物浓度。

米氏方程

Michaelis-Menten 模型描述了底物浓度 [S] 和反应速度 V 之间的关系：

V = Vmax × [S] / (Km + [S])

Vmax 是酶被底物饱和时的最大速度。 Km（米氏常数）是反应速率为 Vmax 一半时的底物浓度。它反映了酶对其底物的亲和力：低 Km 意味着高亲和力。

米氏图

当速度相对于底物浓度绘制时，所得曲线是双曲线。在低底物浓度下，速度线性增加。随着底物浓度增加，曲线渐近接近 Vmax。

Lineweaver-Burk 图

Lineweaver-Burk 图通过取两边的倒数来线性化 Michaelis-Menten 方程：

1/V = (公里/Vmax) × 1/[S] + 1/Vmax

x 轴截距为 -1/Km，y 轴截距为 1/Vmax。该图对于确定动力学参数和识别酶抑制类型很有用。

成交量（千猫）

转换数 kcat 表示每秒每个酶分子转化为产物的底物分子数。计算公式为 kcat = Vmax / [E]total。 kcat/Km 比率衡量催化效率。

实用米氏检测方案

将感兴趣的酶纯化至均质并通过 BCA 测定确定其浓度。在测定缓冲液中准备 10× 底物库存。在 96 孔板中，设置 12 个底物浓度，范围为估计 Km 的 0.2 倍至 10 倍 - 使用连续 2 倍稀释（例如 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 µM）。添加 20 µL 底物、160 µL 测定缓冲液，并用 20 µL 酶溶液开始反应（调整最终浓度以提供可测量的速率）。使用分光光度计或荧光计在适当的波长下连续测量产物形成 5-10 分钟（例如，脱氢酶反应在 340 nm 处的 NADH 吸光度）。从进度曲线的线性部分（通常是前 1-3 分钟）计算初始速度 (V0)，单位为 µM 产品/分钟。绘制 V0 与 [S] 的关系图，并使用 GraphPad Prism 或类似软件中的非线性回归拟合 Michaelis-Menten 方程。从拟合中提取 Vmax 和 Km。对于 Lineweaver-Burk 图，计算 1/V0 和 1/[S]，然后在 y 轴上绘制 1/V0，在 x 轴上绘制 1/[S]。 x 轴截距 = −1/Km，y 轴截距 = 1/Vmax。对于抑制剂表征，请在 2-3 个抑制剂浓度下重复测定。竞争性抑制显示出共同的 y 截距，且斜率不断增加（Km 增加，Vmax 不变）；非竞争性抑制表现出共同的 x 截距和 y 截距减小（Vmax 减小，Km 不变）。通过重新绘制斜率与抑制剂浓度的关系来计算 Ki。

实际应用

使用乙酰硫代胆碱作为底物，使用 DTNB（埃尔曼试剂）在 412 nm 处检测硫代胆碱产物来测定乙酰胆碱酯酶 (AChE)。反应的 Km 为 50 µM，Vmax 为 150 µmol/min/mg。抑制剂多奈哌齐（一种阿尔茨海默病药物）显示出竞争性抑制作用，Ki 为 2 nM。这一特性验证了多奈哌齐作为一种有效的、可逆的 AChE 抑制剂，并支持其临床给药方案。