荧光原位杂交使用荧光标记的DNA探针检测和定位中期染色体及间期核中的特定DNA序列，实现基因组组织和异常的直接可视化。

原理

FISH遵循与比色原位杂交相同的杂交原理，但使用荧光团偶联探针进行直接检测，无需酶促扩增。荧光信号通过落射荧光或共聚焦显微镜观察。多个具有不同荧光团的探针可同时应用，实现单个标本中多个基因组位点的多色分析。

探针类型

位点特异性探针靶向独特的基因组区域，通常为50–500 kb，克隆到BAC或fosmid中。通过使用荧光核苷酸如SpectrumOrange、SpectrumGreen或Cy5进行切口平移标记。着丝粒探针靶向α卫星重复序列并识别特定染色体。端粒探针标记染色体末端。全染色体涂染探针是单一染色体独特序列的复杂混合物，通过流式分选或显微切割生成。基于微阵列合成的寡核苷酸探针组现在提供可定制的高分辨率覆盖。

标记方法

直接标记在探针合成过程中掺入荧光团偶联核苷酸。杂交后即可直接检测。间接标记掺入半抗原如地高辛或生物素，在杂交后用荧光团偶联抗体或链霉亲和素检测。间接方法通过抗体层提供信号放大，适用于小靶标。酪酰胺信号放大进一步提高灵敏度。

样品制备

中期染色体铺片从秋水仙胺阻滞的细胞培养物制备，经低渗膨胀，并用甲醇:乙酸（3:1）固定。间期核从非培养细胞或固定组织获得。标本经老化、RNase和胃蛋白酶处理以减少背景，并通过乙醇系列脱水。对双链探针需要在70%甲酰胺中于72 °C对靶DNA进行变性。使用杂交缓冲液中进行热变性的无甲酰胺方案是替代方法。

杂交与洗涤

探针和靶标在75 °C共同变性5分钟，然后在37 °C在湿盒中杂交4–16小时。杂交后在SSC和Tween-20中洗涤以去除未结合探针。严格性通过甲酰胺浓度、洗涤温度和盐浓度控制。洗涤后，玻片用DAPI复染，在中期染色体上产生Q显带模式，用于核型鉴定。

多色FISH

多重FISH（M-FISH）使用五种荧光团的组合标记方案，生成24个染色体特异性探针组，每个具有独特的光谱特征。光谱核型分析采用类似方法结合成像光谱。这些技术能够在单次实验中实现全面的核型分析，检测复杂重排、标记染色体和隐蔽易位。

应用

FISH是产前诊断中检测染色体非整倍体的临床主要方法，使用非培养羊水细胞和绒毛膜绒毛样本。乳腺癌中HER2基因扩增状态常规通过FISH评估。慢性粒细胞白血病中BCR-ABL融合检测使用间期核上的双色双融合探针。费城染色体t(9;22)显示为融合信号。福尔马林固定石蜡包埋组织切片上的FISH绘制实体瘤的基因组变化。染色体特异性涂染在放射生物学中通过微核和易位分析定量DNA损伤和修复。