快速蛋白质液相色谱是一种中压色谱系统，专为在保留其天然结构和活性的条件下制备型纯化蛋白质和其他生物分子而设计。

原理

FPLC的操作原理与HPLC相同，但在较低操作压力下（通常低于5 MPa）并使用生物相容性流路。系统包括提供精确控制的流动相梯度的泵、用于样品进样的进样器、填充有分离介质的色谱柱、监测UV吸收（蛋白质通常为280 nm）、电导率和pH的检测器，以及级分收集器。生物相容性构造——惰性PEEK或钛流路——防止蛋白质变性和金属催化氧化。

色谱柱与介质

FPLC色谱柱范围从1 mL（分析型）到升（工艺规模）。预填充柱如HiTrap和HiPrep系列提供各种化学性质。介质通常为琼脂糖基（Sepharose、Superose）或聚合物基（Superdex、Source），具有可控粒径，在中等流速和压力下优化分辨率。色谱柱化学性质包括离子交换（IEX）、尺寸排阻、疏水相互作用、反相和亲和层析，包括protein A、IMAC和GST结合树脂。

系统组件

双柱塞泵提供从0.001到50 mL/min的精确流速。梯度混合器可混合最多四种缓冲液，实现多步洗脱方案。UV检测器测量280 nm以及可选260 nm（核酸）和214 nm（肽键）的吸光度。电导率监测缓冲液盐浓度，pH电极跟踪洗脱条件。级分收集器基于峰检测阈值将洗脱液分配到管或微孔板中。现代系统（ÄKTA系列）由软件控制，实现方法、数据采集和级分收集的自动化。

方法开发

典型纯化从将样品缓冲液交换或透析到起始缓冲液中开始。用5–10倍柱体积起始缓冲液平衡色谱柱。通过样品环或superloop以0.5–2 mL/min上样。上样后，洗脱未结合物质直到UV基线稳定。通过阶跃或线性梯度进行洗脱，连续监测。在洗脱峰上收集级分。运行间进行柱清洗和消毒以防止残留。

放大

FPLC方法按柱体积线性放大。参数如线性流速（cm/h）、样品负载（mg每mL树脂）、梯度体积（柱体积）和级分大小（mL）在规模间保持恒定。在1 mL柱体积下的方法开发可直接转化到5、50或500 mL的制备柱。

应用

FPLC是实验室规模蛋白质纯化的主力。它用于从细菌、昆虫或哺乳动物细胞裂解液中纯化重组蛋白，从杂交瘤或CHO细胞培养上清中纯化单克隆抗体，以及从组织提取物中纯化天然蛋白。多步纯化方案结合正交分离模式——例如，通过IMAC捕获、通过离子交换中间纯化和通过尺寸排阻抛光——每一步都在同一FPLC系统上运行。