Gateway克隆

Gateway克隆利用噬菌体λ的位点特异性重组系统。它通过使用特定酶识别的重组序列，消除了对限制性内切酶和DNA连接酶的需求。

该系统分两步反应进行：

• BP反应：两侧带有attB位点的PCR产物与含有attP位点的供体载体（pDONR）重组。BP克隆酶混合物催化该反应，产生插入片段两侧带有attL位点的入门克隆。
• LR反应：入门克隆与含有attR位点的目的载体重组。LR克隆酶将插入片段转移到目的载体中，目的载体为靶标生物提供适当的表达元件（启动子、标签、筛选标记）。

Gateway克隆具有方向性，保持阅读框不变，并允许将同一入门克隆穿梭到数十个目的载体中（例如，用于细菌、哺乳动物细胞、酵母或植物中的表达）。主要限制是重组位点的大小（attB1和attB2各约50 bp），这会给表达的蛋白质增加额外的氨基酸，除非通过蛋白酶切割步骤去除。

TOPO克隆

TOPO克隆利用痘苗病毒拓扑异构酶I，该酶切割DNA并共价结合在3’磷酸上。线性化的TOPO载体两端都连接有拓扑异构酶。当添加具有兼容末端的PCR产物时，拓扑异构酶重新连接载体，插入PCR产物——无需连接酶。

TOPO TA克隆：Taq聚合酶为PCR产物添加单个3’-A突出端。TOPO载体具有互补的3’-T突出端。将PCR产物与线性化载体在室温下混合5分钟，然后转化到感受态细胞中。这是可用的最简单的克隆方法，无需限制性酶切、连接或PCR后纯化。

TOPO平末端克隆：具有平末端的PCR产物（来自校正聚合酶）使用针对平末端连接优化的TOPO载体版本进行克隆。使用正确载体时，效率与TA克隆相当。

两者之间的选择

TOPO克隆更快（室温5分钟），更适合单个插入片的快速亚克隆。Gateway需要更多准备工作（PCR引物上的attB适配器、单独的入门载体和目的载体），但可扩展到高通量应用，并使表达系统之间的切换变得轻而易举。