随着合成生物学构建体复杂性的增加，传统的限制性克隆变得不切实际。Gibson组装和Golden Gate克隆允许在单管反应中进行多片段组装。

Gibson组装

Gibson组装在50 °C的单一等温反应中连接具有重叠末端的多个DNA片段。反应混合物包含三种酶活性：

• 5’核酸外切酶（T5核酸外切酶或RecE）：消化双链DNA的5’末端，留下允许互补片段退火的单链3’突出端。
• DNA聚合酶（Phusion或Taq）：填补退火后留下的间隙。
• DNA连接酶（Taq连接酶）：密封组装DNA中的缺口。

每个片段必须在连接处与其相邻片段具有15–40 bp的同源性。这些重叠通过PCR引物添加。Gibson组装可同时连接2–15个片段。组装是无痕的——最终产物中不留下任何限制性位点。

反应需要每种片段50–100 ng等摩尔量，在50 °C下15–60分钟即可完成。产物直接转化到化学感受态大肠杆菌中。Gibson组装适用于：

• 从寡核苷酸组装合成基因。
• 从重叠片段构建完整质粒。
• 构建带有同源臂的基因组工程盒。
• 创建用于定向进化的DNA文库。

Golden Gate克隆

Golden Gate克隆使用IIS型限制性内切酶（BsaI、BpiI、Esp3I），这些酶在其识别序列之外切割，产生确定的4 bp单链突出端。这些突出端可由用户指定。

该反应是同步酶切连接：将IIS型酶和T4 DNA连接酶一起加入单个试管中，反应混合物在酶的最适温度（BsaI为37 °C）和16 °C或37 °C（用于连接）之间循环。由于识别位点从最终组装产物中被移除，反应被驱动至完成——组装的产物不能被重新酶切。

Golden Gate是模块化克隆标准（如MoClo、Golden Braid和Plant Toolbox）的基础。它适用于：

• 遗传元件（启动子、5’ UTR、CDS、终止子、标签）的组合组装。
• 从单个重复模块构建TALEN阵列。
• 为CRISPR筛选构建混合sgRNA文库。

突出端被设计为按定义顺序相互兼容，允许同一载体接受不同的元件组合。Golden Gate在模块化组合项目方面比Gibson组装更具可扩展性，但要求片段不含所用酶的内部识别位点。