疏水相互作用层析根据表面疏水性的差异分离蛋白质。蛋白质在高盐条件下上样，促进与固定相的疏水相互作用，并通过降低盐浓度洗脱，削弱疏水效应。

原理

在高盐浓度下，水分子围绕盐离子有序排列（盐析效应），减少了可用于溶剂化蛋白质表面疏水斑块的水。这迫使蛋白质上的疏水区域与固定在层析介质上的疏水配体相互作用。在洗脱过程中当盐浓度降低时，水变得更加可用，疏水相互作用减弱，蛋白质按表面疏水性增加的顺序洗脱。结合取决于盐的类型和浓度，硫酸铵、硫酸钠和NaCl是常见选择，按霍夫迈斯特系列根据其盐析强度排列。

选择性与分辨率

HIC选择性与离子交换层析和尺寸排阻层析正交。分辨率取决于配体类型（烷基——丁基、辛基、苯基）、配体密度、盐梯度斜率和温度。10–20倍柱体积的线性梯度通常提供最佳分辨率。阶跃洗脱用于工艺规模捕获。苯基配体提供疏水和芳香相互作用，提供与直链烷基配体不同的选择性。

色谱柱介质

常见HIC树脂包括丁基-和辛基-Sepharose（GE Healthcare）、Phenyl和Butyl Toyopearl（Tosoh）以及Macro-Prep t-Butyl和Methyl HIC支持物（Bio-Rad）。树脂疏水性变化：丁基 > 辛基用于等效密度的烷基链。30–100 µm的粒径在制备工作中平衡分辨率和流动特性。

缓冲液考虑

上样缓冲液含1–2 M硫酸铵或3–4 M NaCl。洗脱使用相同缓冲液但不含盐。降低pH或包含乙二醇进一步减少紧密结合蛋白的疏水相互作用。应避免去垢剂，因为它们干扰疏水结合。样品通常通过添加固体盐或用浓缩盐储备溶液稀释来直接调整。

方法开发

从小型筛选柱（1 mL）开始，测试两种或三种树脂化学性质在两种盐浓度下的表现。每mL树脂上样5–10 mg蛋白。用5倍柱体积上样缓冲液洗涤。用10倍柱体积线性梯度至零盐洗脱。收集1 mL级分并通过SDS-PAGE分析。针对目标分离优化梯度斜率。

应用

HIC广泛用于生物制药制造作为中间纯化或抛光步骤。它有效去除聚集体、剪切亚型和宿主细胞蛋白，在捕获步骤如Protein A或IMAC之后进行。HIC在去除疏水污染物包括内毒素、DNA结合蛋白和病毒颗粒方面特别有效。它通常与FPLC系统配合使用以实现自动化方法执行。