免疫荧光（IF）和免疫细胞化学（ICC）是基于抗体的技术，可揭示蛋白质在细胞内亚细胞水平的位置。IF 使用荧光染料；ICC 使用生色酶。两者都对细胞生物学、病理学和药物发现至关重要。

直接与间接方法

直接 IF：一抗直接与荧光团偶联。快速且背景低，但信号放大有限。

间接 IF：未偶联的一抗结合靶标，荧光团偶联的二抗结合一抗。由于每个一抗可结合多个二抗，因此产生信号放大。这是最常见的方法，可与来自同一宿主物种的许多一抗配合使用。

样品制备

1. 固定：保存细胞结构并固定抗原。4% 多聚甲醛是最常用的 IF 固定液。甲醇/丙酮固定更快但可能扭曲形态。
2. 通透：允许抗体进入细胞内抗原。Triton X-100 或皂苷处理 10–15 分钟。如果仅染色细胞表面抗原则跳过通透。
3. 封闭：与 1–5% BSA、5–10% 正常血清或商业封闭缓冲液孵育 30–60 分钟，防止非特异性抗体结合。
4. 一抗：在封闭缓冲液中于 4 °C 孵育过夜或室温 1–2 小时。经验性优化稀释度。
5. 洗涤：PBS 中 3 × 5 分钟。
6. 二抗：在室温下避光孵育 1 小时。
7. 洗涤：PBS 中 3 × 5 分钟。
8. 复染和封片：DAPI 或 Hoechst 33342 对细胞核染色。用抗淬灭封片剂封片。

对照

• 无一抗对照：仅二抗——应无特异性染色。
• 同型对照：用相同同型的非特异性抗体替代一抗。
• 封闭肽对照：将一抗与免疫肽预孵育以消除特异性染色。
• 敲除对照：缺乏靶蛋白的细胞确认抗体特异性。

多重染色

使用在不同宿主物种中产生的一抗和偶联不同荧光团的物种特异性二抗，可同时对多种蛋白质成像。光谱拆分或窄带滤光片防止通道之间的串扰。

图像采集

对于薄样品或切片使用宽场荧光显微镜，对于较厚样品使用共聚焦显微镜，对于超分辨率成像使用结构光照明显微镜或 STED 显微镜。根据无一抗对照设置曝光时间，确保特异性信号高于背景。