基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种软电离技术，能够分析蛋白质、肽、脂质和寡核苷酸等大分子非挥发性生物分子。它广泛用于蛋白质组学、临床微生物学和聚合物分析。

在MALDI中，分析物与基质化合物共结晶，基质通常是在激光波长处强烈吸收的小分子有机酸。常见的基质包括用于肽的α-氰基-4-羟基肉桂酸和用于蛋白质的芥子酸。脉冲紫外激光（通常为337 nm氮气激光或355 nm Nd:YAG激光）照射样品，引起基质和分析物离子的快速加热和解吸。基质通过质子转移促进电离，主要产生单电荷离子且碎片化程度最低。

飞行时间分析器根据质荷比分离离子，通过测量离子在无场飞行管中飞行所需的时间来实现。较小的离子更快到达检测器。飞行时间与m/z的平方根成正比。延时提取和离子反射镜通过补偿初始能量分散来提高分辨率。

MALDI-TOF MS用于蛋白质鉴定中的肽质量指纹图谱分析，将胰蛋白酶肽的质量与蛋白质数据库的理论酶切结果进行匹配。在临床微生物学中，直接分析完整细菌细胞，并将得到的蛋白质质谱与参考文库进行比较以进行物种鉴定。这种方法通过实现数分钟内的快速鉴定，彻底改变了临床微生物学。

局限性包括定量分析的重现性较差、低质量范围的基质干扰以及500 Da以下分析物的灵敏度降低。MALDI成像将该技术扩展到直接在组织切片上绘制生物分子的空间分布。