传统的限制性酶克隆已被更快、无疤痕且兼容高通量工作流程的重组和模块化组装方法补充——在许多实验室中已被取代。

Gateway 克隆

Gateway 克隆使用噬菌体 λ 的位点特异性重组系统。两次连续的重组反应将目标 DNA 序列在载体之间转移，无需限制性酶或连接酶。

在 BP 反应中，两侧带有 attB 位点的 PCR 产物与含有 attP 位点的供体载体重组，产生入门克隆。LR 反应随后将插入片段从入门克隆转移到任何含有 attR 位点的目的载体中。目的载体提供适合目标生物体的表达元件。

Gateway 克隆具有方向性，不会改变阅读框，并允许将同一个入门克隆穿梭到多个目的载体中。其主要限制是重组位点的大小（每个约 50 bp），这会向最终构建体添加额外序列。

Gibson Assembly

Gibson Assembly 在单个等温反应中将多个 DNA 片段连接在一起。它需要三种酶活性：

• 5′ 核酸外切酶回切 5′ 端，留下重叠的单链 3′ 突出端。
• DNA 聚合酶填补缺口。
• DNA 连接酶封闭切口。

片段末端必须具有 15–40 bp 的重叠序列，通常通过 PCR 引物添加。Gibson Assembly 可同时连接多达 10–15 个片段，非常适合组装大片段构建体，如合成基因、完整质粒或基因组工程化 cassette。组装是无疤痕的——不留下限制性位点。

Golden Gate 克隆

Golden Gate 克隆使用 IIS 型限制性酶，在其识别序列之外切割，产生确定的 4 bp 突出端。这些突出端可由用户指定，并设计为独特且兼容的。

反应是一锅法消化-连接：将 IIS 型酶和 T4 DNA 连接酶一起加入，反应在酶的最近温度和 37 °C 之间循环。由于切割后识别位点被移除，最终组装产物不再可被消化，推动反应完成。

Golden Gate 是模块化克隆系统（如 MoClo）的基础。它非常适合基因元件的组合组装以及构建 TALEN 阵列或 sgRNA 文库。