非变性 PAGE

与 SDS-PAGE 不同，非变性 PAGE 在天然构象下分离蛋白质，不使用 SDS 或还原剂。迁移速率取决于蛋白质的大小和其固有电荷，使得分子量估计不如 SDS-PAGE 直接——但保留了酶活性和蛋白质-蛋白质相互作用。

缓冲液：最常用的是不含 SDS 的 Laemmli 缓冲液系统。分离胶为 pH 8.8，浓缩胶为 pH 6.8，均使用 Tris-甘氨酸电泳缓冲液。蛋白质在电泳 pH 下带净负电，向阳极迁移。

蓝色非变性 PAGE：在阴极缓冲液和蛋白质样品中加入考马斯亮蓝 G-250。染料与疏水表面结合，赋予均一的负电荷而不变性蛋白质。这使得在标准非变性条件下不溶的膜蛋白复合物得以分离。

应用：

• 确定蛋白质的寡聚状态。
• 通过 Western blot 或酶切后质谱分析多蛋白复合物。
• 检测具有不同电泳迁移率的酶同工型。
• 蛋白质纯化的质量控制。

局限性：分辨率通常低于 SDS-PAGE。酸性和碱性蛋白在同一凝胶系统中迁移不佳。使用天然分子量标记校准仅给出近似大小。

酶谱分析

酶谱分析通过将底物共聚到分离胶中，直接在聚丙烯酰胺凝胶中检测酶活性。电泳后，凝胶在复性缓冲液中孵育以恢复酶活性，然后染色。酶活性表现为深色背景上底物被降解的透明条带。

酶谱类型：

• 明胶酶谱：加入 0.1% 明胶。用于基质金属蛋白酶。孵育后，用考马斯亮蓝染色——MMP 活性表现为蓝色背景上的白色/透明条带。
• 酪蛋白酶谱：酪蛋白为底物。用于丝氨酸蛋白酶和纤溶酶原激活剂。
• 反向酶谱：凝胶同时含有底物和抑制剂。抑制剂活性表现为底物未被降解的深色条带。
• 胶内激酶测定：凝胶与蛋白激酶底物聚合，电泳、复温并与 [γ-³²P]ATP 孵育后，通过放射自显影检测磷酸化条带。

明胶酶谱操作概要：

1. 制备含 0.1% 明胶的分离胶。
2. 在非还原条件下上样。
3. 在 4 °C 电泳以防止过早蛋白水解。
4. 通过在 2.5% Triton X-100 中洗涤凝胶去除 SDS。
5. 在显色缓冲液中于 37 °C 孵育 16–48 小时。
6. 用考马斯亮蓝染色并脱色。

酶谱分析高度灵敏，并可基于分子量区分酶原和活性形式。