Protein A和Protein G是结合抗体Fc区的细菌免疫球蛋白结合蛋白，能够从血清、腹水或细胞培养上清中快速一步纯化多克隆和单克隆抗体。

原理

Protein A（来自金黄色葡萄球菌）和Protein G（来自链球菌属）特异性结合IgG抗体的Fc区，而不识别抗原结合的Fab区。这保留了纯化后的抗体功能。这些细菌蛋白固定在琼脂糖或磁珠上，用作亲和捕获试剂。抗体在生理pH下结合，并在低pH（2.5–3.0）下洗脱，这破坏了Fc-Protein A/G相互作用。洗脱级分立即中和以防止酸催化变性。

Protein A vs. Protein G

Protein A对人IgG亚类的结合亲和力不同：对IgG1、IgG2和IgG4强，但对IgG3弱。它也能很好地结合兔、猪、狗和豚鼠IgG，但弱结合山羊、绵羊、大鼠和小鼠IgG1。Protein G结合更广泛的跨物种IgG亚类，包括所有人IgG亚类、小鼠IgG1、山羊、绵羊和大鼠IgG。Protein A/G是一种重组融合蛋白，结合了两者的结合域，提供最广泛的物种和亚类覆盖。选择取决于抗体物种和同种型。对于大多数多克隆血清，Protein A/G琼脂糖提供最佳产率。

树脂形式

Protein A、Protein G和Protein A/G可偶联到琼脂糖、Sepharose和磁珠上。Protein A Sepharose（Cytiva）和MabSelect SuRe（一种碱稳定的Protein A衍生物）是单克隆抗体纯化的标准。具有改进碱稳定性的重组Protein A变体允许用0.1–0.5 M NaOH清洁以去除内毒素。结合容量范围为每mL树脂5–20 mg人IgG，取决于树脂和流动条件。高容量树脂（30–50 mg/mL）用于生物加工。

缓冲液系统

上样缓冲液：20 mM磷酸钠，150 mM NaCl，pH 7.4（PBS）或20 mM Tris-HCl，pH 7.5–8.0。洗涤缓冲液：与上样相同，有时含0.1% Tween-20或1 M NaCl用于严格洗涤。洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸-盐酸，pH 2.5–3.0，或0.1 M柠檬酸盐，pH 3.0。中和缓冲液：1 M Tris-HCl，pH 8.5–9.0（每mL洗脱液加入50–100 µL）。对于温和洗脱，可使用2–3 M MgCl₂或3.5 M KSCN，但这些促溶剂可能影响某些抗体。

方案

用上样缓冲液平衡Protein A/G树脂。上样澄清血清（用上样缓冲液1:1稀释）或培养上清（低滴度时浓缩10倍），流速0.5–1 mL/min或分批旋转30分钟，4 °C。用10–15倍柱体积上样缓冲液洗涤，直到A₂₈₀达到基线。用5–10倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，收集0.5–1 mL级分到含有中和缓冲液的管中。合并A₂₈₀峰值级分并透析或缓冲交换到PBS或储存缓冲液中。还原条件下的SDS-PAGE显示25 kDa（轻链）和50 kDa（重链）条带。

亲和成熟和工程变体

重组Protein A变体（MabSelect SuRe、ProSep Ultra Plus）经过工程改造，具有更高的结合容量、改进的碱稳定性（>0.5 M NaOH耐受性用于在线清洗）和减少的配体泄漏。这些树脂对于生物制药制造中柱重复使用（>100次循环）和严格纯度要求至关重要。

应用

Protein A/G纯化是研究和工业中抗体纯化的金标准。来自杂交瘤上清的单克隆抗体、来自兔或山羊血清的多克隆抗体以及来自CHO细胞培养的人治疗性单克隆抗体均常规通过该方法纯化。抗体-抗原复合物的免疫沉淀使用Protein A/G磁珠捕获抗体及其结合的抗原。对于高通量形式，Protein A/G用于多重亲和捕获和96孔板抗体筛选。